定量微管分离技术分离小鼠组织中稳定的微管、不稳定的微管和游离微管蛋白

我们的新方案有助于区分和量化管环的三种状态，例如动物组织中的稳定微管、不稳定微管和游离小管。该技术由简单的步骤组成，可以评估管材的结构稳定性，这不能通过对管材平移后修饰的量化来检测。该方法对于研究和开发对微管稳定性至关重要的疾病（如阿尔茨海默病和癌症）的治疗方法至关重要。

通过准备用于组织解剖的实验室服装来开始该过程。用碎冰装满一个盒子，然后在上面放两个培养皿。用冰冷的磷酸盐缓冲溶液或PBS填充一个培养皿，用于解剖组织的瞬时洗涤和储存。

将用PBS润湿的滤纸放在第二个培养皿上。接下来，称量装有PBS的1.5毫升微管，用于解剖组织储存。从安乐死的小鼠中提取组织后，将它们转移到试管中并重新称量每个微管。

将组织移入具有冰冷微管稳定缓冲液或MSB +培养基的玻璃匀浆器中，并立即使用冷冻匀浆器匀浆组织。现在使用巴斯德移液管将组织匀浆转移到两毫升微管中，并在2摄氏度下以2,400G离心三分钟。将上清液转移到新的 1.5 毫升微管中以除去碎屑。

在新的 1.5 毫升微管中涡旋上清液或 S1 级分。立即将 200 微升 S1 馏分移液到离心微管中，并使用 TLA-55 转子在 2 摄氏度下以 100， 000 G 离心 20 分钟。第二次离心后，将S2上清液与P2沉淀物分离。

立即将全部的 S2 馏分转移到离心微管中，并使用 TLA-120.2 转子在 2 摄氏度下以 500， 000 G 旋转 60 分钟。第三次离心后，将S3上清液与P3沉淀物分离。将整个 S3 馏分溶解在 200 微升 2X 十二烷基硫酸钠或 SDS 样品缓冲液中。

将剩余的 S1 级分与等体积的 2X SDS 样品缓冲液混合，用作蛋白质印迹的标准曲线。接下来，向 P2 和 P3 馏分管中加入 400 微升 SDS 样品缓冲液。然后，在将样品转移到新的 1.5 毫升微管中并将它们放入冰箱中之前，短暂地超声处理溶液以溶解沉淀物。

将所有样品在 100 摄氏度下煮沸三分钟。P2组分的微管占小鼠脑中α-微管蛋白总量的34.86%，而P3和S3组分的微管分别占56.13%和9.01%。P2、P3和S3组分中β-3微管蛋白的百分比与α-微管蛋白的百分比无显著差异。

S2 组分显示微管蛋白通过 300 千道尔顿超滤离心柱的通过有限，而 S3 组分允许微管蛋白复合物完全通过。色谱分离导致 S3 微管蛋白洗脱 100 千道尔顿。在每个馏分中回收等比例的α-和β-微管蛋白。

P2组分显著富集乙酰化α-微管蛋白，而酪氨酸化α-微管蛋白在P3组分中占主导地位。在匀浆之前冷冻大脑导致 P2 组分中 α-微管蛋白浓度降低。然而，α-微管蛋白在P3组分中增加。

冷冻还降低了 P2 组分中 α-微管蛋白的乙酰化水平并增加了酪氨酸化水平。诺考达唑治疗降低了 P2 组分中的 α-微管蛋白。与冷冻相比，诺考达唑不影响P2微管蛋白翻译后修饰。

脑组织中P2微管蛋白浓度显著升高，而P3微管蛋白集中在增殖组织中。Western blotting显示，在神经系统中特异性发现的P2微管蛋白起源于稳定的微管，而P3微管蛋白起源于不稳定的微管。微管的稳定性是高度动态的。

在低温环境中快速、不间断地完成该协议非常重要。还要确保组织和馏分在溶解在SDS样品缓冲液中之前没有被冷冻。将使用每个组分的免疫呈递与蛋白质组学相结合，有望确定参与微管动力学的因素。

使用这种方法，我们揭示了正常tau蛋白如何存在于微管上。它还可用于研究它在老年大脑中如何变得异常，以确定痴呆的新药物靶点。