Il nostro nuovo protocollo aiuta a distinguere e quantificare tre stati degli anelli tubolari, come i microtubuli stabili, i microtubuli labili e i tubuli liberi nei tessuti animali. Questa tecnica è composta da semplici passaggi e può valutare la stabilità strutturale del tubo, che non può essere rilevata dalla quantificazione della modifica post-traduzionale del tubo. Questo metodo è essenziale per la ricerca e lo sviluppo di metodi terapeutici per le malattie in cui la stabilità dei microtubuli è fondamentale, come il morbo di Alzheimer e i tumori.
Iniziare la procedura preparando l'abbigliamento da laboratorio per la dissezione dei tessuti. Riempi una scatola con ghiaccio tritato e posizionaci sopra due piastre di Petri. Riempire un piatto con soluzione tampone fosfato ghiacciata o PBS per il lavaggio transitorio e la conservazione dei tessuti sezionati.
Adagiare la carta da filtro inumidita con PBS sul secondo piatto. Successivamente, pesare le microprovette da 1,5 millilitri riempite con PBS per la conservazione dei tessuti dissezionati. Dopo aver estratto i tessuti da un topo sottoposto a eutanasia, trasferirli nelle provette e pesare nuovamente ogni microprovetta.
Spostare i tessuti in un omogeneizzatore di vetro con tampone stabilizzante dei microtubuli ghiacciato o MSB+medium e omogeneizzare immediatamente il tessuto utilizzando un omogeneizzatore refrigerato. Ora trasferisci l'omogenato tissutale in una microprovetta da due millilitri utilizzando una pipetta Pasteur e centrifuga a 2.400 G per tre minuti a due gradi Celsius. Trasferire il surnatante in un nuovo microtubo da 1,5 millilitri per rimuovere i detriti.
Vorticare il surnatante o la frazione S1 in un nuovo microtubo da 1,5 millilitri. Pipettare immediatamente 200 microlitri della frazione S1 in una microprovetta di centrifugazione e centrifugare a 100.000 G utilizzando un rotore TLA-55 per 20 minuti a due gradi Celsius. Dopo la seconda centrifugazione, separare il surnatante S2 dal precipitato P2.
Trasferire immediatamente l'intera quantità della frazione S2 in una microprovetta di centrifugazione e utilizzare un rotore TLA-120.2 per farla girare a 500.000 G per 60 minuti a due gradi Celsius. Dopo la terza centrifugazione, separare il surnatante S3 dal precipitato P3. Sciogliere l'intera frazione S3 in 200 microlitri di 2X sodio dodecil solfato o tampone campione SDS.
Miscelare le restanti frazioni S1 con un volume uguale di tampone campione SDS 2X da utilizzare come curva standard per il western blotting. Successivamente, aggiungere 400 microlitri di tampone per campioni SDS alle provette della frazione P2 e P3. Quindi, sonicare brevemente la soluzione per sciogliere il precipitato prima di trasferire i campioni in nuove microprovette da 1,5 millilitri e posizionarle nella ghiacciaia.
Far bollire tutti i campioni a 100 gradi Celsius per tre minuti. I microtubuli nella frazione P2 rappresentavano il 34,86% dell'alfa-tubulina totale nel cervello di un topo, mentre quelli nelle frazioni P3 e S3 rappresentavano rispettivamente il 56,13% e il 9,01%. La percentuale di beta-3 tubulina nelle frazioni P2, P3 e S3 non era significativamente diversa da quella dell'alfa-tubulina.
La frazione S2 ha mostrato un passaggio limitato di tubulina attraverso una colonna di spin di ultrafiltrazione da 300 kilodalton, mentre la frazione S3 ha permesso il passaggio completo dei complessi di tubulina. La separazione cromatografica ha portato a un'eluizione di 100 kilodalton di tubulina S3. Proporzioni uguali di alfa e beta-tubulina sono state recuperate in ciascuna frazione.
Le frazioni P2 sono state significativamente arricchite con alfa-tubulina acetilata, mentre l'alfa-tubulina tirosinata era dominante nella frazione P3. Il congelamento del cervello prima dell'omogeneizzazione ha provocato una diminuzione della concentrazione di alfa-tubulina nelle frazioni P2. Tuttavia, l'alfa-tubulina è aumentata nella frazione P3.
Il congelamento ha anche diminuito i livelli di acetilazione e aumentato i livelli di tirosinazione dell'alfa-tubulina nella frazione P2. Il trattamento con nocodazolo ha ridotto l'alfa-tubulina nella frazione P2. A differenza del congelamento, il nocodazolo non ha influenzato le modificazioni post-traduzionali della tubulina P2.
Il tessuto cerebrale ha mostrato una concentrazione significativamente più elevata di tubuline P2, mentre le tubuline P3 erano concentrate nel tessuto proliferativo. Il Western blotting ha mostrato che la tubulina P2 specificamente presente nel sistema nervoso ha avuto origine da microtubuli stabili e la tubulina P3 ha avuto origine da microtubuli labili. La stabilità dei microtubuli è altamente dinamica.
È importante completare questo protocollo rapidamente, senza interruzioni, in un ambiente a basse temperature. Assicurarsi inoltre che i tessuti e le frazioni non siano stati congelati fino a quando non sono stati sciolti nel tampone del campione SDS. La combinazione della presentazione immunitaria utilizzando ciascuna frazione con la proteomica dovrebbe identificare i fattori coinvolti nella dinamica dei microtubuli.
Usando questo metodo, abbiamo rivelato come la tau normale esista sui microtubuli. Può anche essere utilizzato per studiare come diventa anormale nei cervelli invecchiati al fine di identificare nuovi bersagli farmacologici della demenza.
