Nosso novo protocolo ajuda a distinguir e quantificar três status de anéis de tubo, como microtúbulos estáveis, microtúbulos lábeis e túbulos livres em tecidos animais. Esta técnica é composta por etapas simples e pode avaliar a estabilidade estrutural da tubulação, que não pode ser detectada pela quantificação da tubulação pós-modificação translacional. Este método é essencial para a pesquisa e desenvolvimento de formas terapêuticas para doenças onde a estabilidade dos microtúbulos é crítica, como a doença de Alzheimer e cânceres.
Inicie o procedimento preparando o desgaste de laboratório para a dissecção do tecido. Encha uma caixa com gelo picado e coloque duas placas de Petri sobre ela. Encha um prato com solução tampão fosfato gelada ou PBS para lavagem transitória e armazenamento dos tecidos dissecados.
Coloque papel filtro umedecido com PBS no segundo prato. Em seguida, pesar os microtubos de 1,5 mililitro preenchidos com PBS para armazenamento do tecido dissecado. Depois de extrair os tecidos de um camundongo eutanasiado, transfira-os para os tubos e pese novamente cada microtubo.
Mover os tecidos para um homogeneizador de vidro com tampão estabilizador de microtúbulos gelado ou meio MSB+, e homogeneizar o tecido imediatamente usando um homogeneizador refrigerado. Agora transfira o homogeneizado de tecido para um microtubo de dois mililitros usando uma pipeta de Pasteur e centrífuga a 2.400 G por três minutos a dois graus Celsius. Transfira o sobrenadante para um novo microtubo de 1,5 mililitro para remover os detritos.
Vórtice o sobrenadante ou a fração S1 em um novo microtubo de 1,5 mililitro. Pipetar imediatamente 200 microlitros da fração S1 em um microtubo de centrifugação e centrifugar a 100.000 G usando um rotor TLA-55 por 20 minutos a dois graus Celsius. Após a segunda centrifugação, separar o sobrenadante S2 do precipitado P2.
Transfira imediatamente toda a quantidade da fração S2 para um microtubo de centrifugação e use um rotor TLA-120.2 para girá-lo a 500.000 G por 60 minutos a dois graus Celsius. Após a terceira centrifugação, separar o sobrenadante S3 do precipitado P3. Dissolva toda a fração S3 em 200 microlitros de dodecil sulfato de sódio 2X, ou tampão de amostra SDS.
Misture as frações S1 restantes com um volume igual de buffer de amostra SDS 2X para uso como uma curva padrão para western blotting. Em seguida, adicione 400 microlitros de tampão de amostra SDS aos tubos de fração P2 e P3. Em seguida, sonice brevemente a solução para dissolver o precipitado antes de transferir as amostras para novos microtubos de 1,5 mililitro e colocá-los na caixa de gelo.
Ferva todas as amostras a 100 graus Celsius por três minutos. Os microtúbulos da fração P2 representaram 34,86% da alfa-tubulina total em cérebro de camundongo, enquanto os das frações P3 e S3 representaram 56,13% e 9,01%, respectivamente. A porcentagem de tubulina beta-3 nas frações P2, P3 e S3 não foi significativamente diferente da alfa-tubulina.
A fração S2 mostrou passagem limitada de tubulina através de uma coluna de spin de ultrafiltração de 300 quilodaltons, enquanto a fração S3 permitiu a passagem completa de complexos tubulinos. A separação cromatográfica resultou em uma eluição de 100 quilodalton da tubulina S3. Proporções iguais de alfa e beta-tubulina foram recuperadas em cada fração.
As frações P2 foram significativamente enriquecidas com alfa-tubulina acetilada, enquanto a alfa-tubulina tirosinada foi dominante na fração P3. O congelamento do cérebro antes da homogeneização resultou na diminuição da concentração de alfa-tubulina nas frações P2. Entretanto, a alfa-tubulina aumentou na fração P3.
O congelamento também diminuiu os níveis de acetilação e aumentou os níveis de tirosinação de alfa-tubulina na fração P2. O tratamento com nocodazol diminuiu a alfa-tubulina na fração P2. Ao contrário do congelamento, o nocodazol não afetou as modificações pós-traducionais da tubulina P2.
O tecido cerebral exibiu uma concentração significativamente maior de tubulinas P2, enquanto as tubulinas P3 estavam concentradas no tecido proliferativo. O Western blotting mostrou que a tubulina P2 especificamente encontrada no sistema nervoso originou-se de microtúbulos estáveis, e a tubulina P3 originou-se de microtúbulos lábeis. A estabilidade dos microtúbulos é altamente dinâmica.
É importante completar este protocolo rapidamente, sem interrupções, no ambiente de temperatura fria. Certifique-se também de que os tecidos e fracções não foram congelados até serem dissolvidos em tampão de amostra SDS. Espera-se que a combinação da apresentação imune usando cada fração com proteômica identifique fatores envolvidos na dinâmica dos microtúbulos.
Usando este método, revelamos como a tau normal existe nos microtúbulos. Ele também pode ser usado para estudar como se torna anormal em cérebros envelhecidos, a fim de identificar novos alvos de drogas de demência.
