Yeni protokolümüz, hayvan dokularında stabil mikrotübüller, kararsız mikrotübüller ve serbest tübüller gibi üç tüp halkası durumunu ayırt etmeye ve ölçmeye yardımcı olur. Bu teknik basit adımlardan oluşur ve translasyonel modifikasyon sonrası borunun nicelleştirilmesiyle tespit edilemeyen borunun yapısal stabilitesini değerlendirebilir. Bu yöntem, Alzheimer hastalığı ve kanserler gibi mikrotübül stabilitesinin kritik olduğu hastalıklar için terapötik yolların araştırılması ve geliştirilmesi için gereklidir.
Doku diseksiyonu için laboratuvar kıyafetini hazırlayarak prosedüre başlayın. Bir kutuyu kırılmış buzla doldurun ve üzerine iki Petri kabı yerleştirin. Diseke edilmiş dokuların geçici olarak yıkanması ve saklanması için bir kabı buz gibi soğuk fosfat tampon çözeltisi veya PBS ile doldurun.
İkinci tabağın üzerine PBS ile nemlendirilmiş filtre kağıdı koyun. Daha sonra, disseke doku depolaması için PBS ile doldurulmuş 1.5 mililitrelik mikrotüpleri tartın. Dokuları ötenazi yapılmış bir fareden çıkardıktan sonra, bunları tüplere aktarın ve her bir mikrotüpü yeniden tartın.
Dokuları buz gibi soğuk mikrotübül stabilize edici tampon veya MSB+ortam içeren bir cam homojenizatöre taşıyın ve soğutulmuş bir homojenizatör kullanarak dokuyu hemen homojenize edin. Şimdi doku homojenatını bir Pasteur pipeti kullanarak iki mililitrelik bir mikrotüpe aktarın ve iki santigrat derecede üç dakika boyunca 2.400 G'de santrifüjleyin. Kalıntıları temizlemek için süpernatanı yeni bir 1,5 mililitrelik mikrotüpe aktarın.
Süpernatanı veya S1 fraksiyonunu yeni bir 1.5 mililitrelik mikrotüpte vorteksleyin. Hemen 200 mikrolitre S1 fraksiyonunu bir santrifüj mikrotüpüne pipetleyin ve iki santigrat derecede 20 dakika boyunca bir TLA-55 rotoru kullanarak 100.000 G'de santrifüjleyin. İkinci santrifüjlemeden sonra, S2 süpernatantını P2 çökeltisinden ayırın.
S2 fraksiyonunun tamamını hemen bir santrifüj mikrotüpüne aktarın ve iki santigrat derecede 60 dakika boyunca 500.000 G'de döndürmek için bir TLA-120.2 rotoru kullanın. Üçüncü santrifüjlemeden sonra, S3 süpernatantını P3 çökeltisinden ayırın. Tüm S3 fraksiyonunu 200 mikrolitre 2X sodyum dodesil sülfat veya SDS numune tamponunda çözün.
Kalan S1 fraksiyonlarını, batı lekeleme için standart bir eğri olarak kullanmak üzere eşit hacimde 2X SDS numune tamponu ile karıştırın. Ardından, P2 ve P3 fraksiyon tüplerine 400 mikrolitre SDS numune tamponu ekleyin. Ardından, numuneleri yeni 1.5 mililitrelik mikrotüplere aktarmadan ve bunları buz kutusuna yerleştirmeden önce çökeltiyi çözmek için çözeltiyi kısaca sonikleştirin.
Tüm numuneleri 100 santigrat derecede üç dakika kaynatın. P2 fraksiyonundaki mikrotübüller, bir fare beynindeki toplam alfa-tübülünün% 34.86'sını oluştururken, P3 ve S3 fraksiyonlarındakiler sırasıyla% 56.13 ve% 9.01'ini oluşturuyordu. P2, P3 ve S3 fraksiyonlarındaki beta-3 tübülin yüzdesi, alfa-tübülininkinden önemli ölçüde farklı değildi.
S2 fraksiyonu, 300 kilodaltonluk bir ultrafiltrasyon spin kolonundan tübülinin sınırlı geçişini gösterirken, S3 fraksiyonu, tübülin komplekslerinin tam geçişine izin verdi. Kromatografik ayırma, 100 kilodaltonluk bir S3 tubulin elüsyonu ile sonuçlandı. Her fraksiyonda eşit oranlarda alfa ve beta-tubulin geri kazanıldı.
P2 fraksiyonları asetillenmiş alfa-tübülin ile önemli ölçüde zenginleştirilirken, P3 fraksiyonunda tirozinli alfa-tübülin baskındı. Homojenizasyondan önce beynin dondurulması, P2 fraksiyonlarında alfa-tubulin konsantrasyonunun azalmasına neden oldu. Bununla birlikte, P3 fraksiyonunda alfa-tubulin artmıştır.
Dondurma ayrıca asetilasyon seviyelerini düşürdü ve P2 fraksiyonunda alfa-tubulinin tirozinasyon seviyelerini arttırdı. Nokodazol tedavisi, P2 fraksiyonunda alfa-tubulini azalttı. Donmanın aksine, nokodazol P2 tubulin translasyon sonrası modifikasyonları etkilemedi.
Beyin dokusu önemli ölçüde daha yüksek bir P2 tubulin konsantrasyonu sergilerken, P3 tübülinler proliferatif dokuda yoğunlaştı. Western blotlama, özellikle sinir sisteminde bulunan P2 tübülinin kararlı mikrotübüllerden kaynaklandığını ve P3 tübülinin kararsız mikrotübüllerden kaynaklandığını gösterdi. Mikrotübüllerin stabilitesi oldukça dinamiktir.
Bu protokolün hızlı bir şekilde, kesintisiz olarak, soğuk ortamda tamamlanması önemlidir. Ayrıca dokuların ve fraksiyonların SDS numune tamponunda çözülene kadar dondurulmadığından emin olun. Her bir fraksiyonu kullanarak immün sunumu proteomik ile birleştirmenin, mikrotübül dinamiğinde yer alan faktörleri tanımlaması beklenir.
Bu yöntemi kullanarak, mikrotübüllerde normal tau'nun nasıl var olduğunu ortaya çıkardık. Demansın yeni ilaç hedeflerini belirlemek için yaşlı beyinlerde nasıl anormal hale geldiğini incelemek için de kullanılabilir.
