Notre nouveau protocole permet de distinguer et de quantifier trois statuts des anneaux tubulaires, tels que les microtubules stables, les microtubules labiles et les tubules libres dans les tissus animaux. Cette technique est composée d’étapes simples et permet d’évaluer la stabilité structurelle des tubes, qui ne peut pas être détectée par la quantification des tubes après modification translationnelle. Cette méthode est essentielle pour la recherche et le développement de moyens thérapeutiques pour les maladies où la stabilité des microtubules est critique, comme la maladie d’Alzheimer et les cancers.
Commencez la procédure en préparant le vêtement de laboratoire pour la dissection tissulaire. Remplissez une boîte de glace pilée et placez-y deux boîtes de Pétri. Remplissez un plat avec une solution tampon de phosphate glacée ou PBS pour le lavage transitoire et le stockage des tissus disséqués.
Posez du papier filtre imbibé de PBS sur le deuxième plat. Ensuite, pesez les microtubes de 1,5 millilitre remplis de PBS pour le stockage des tissus disséqués. Après avoir extrait les tissus d’une souris euthanasiée, transférez-les dans les tubes et pesez à nouveau chaque microtube.
Déplacez les tissus dans un homogénéisateur en verre avec un tampon stabilisateur de microtubules glacé ou un milieu MSB+, et homogénéisez immédiatement le tissu à l’aide d’un homogénéisateur réfrigéré. Transférez maintenant l’homogénat tissulaire dans un microtube de deux millilitres à l’aide d’une pipette Pasteur et d’une centrifugeuse à 2 400 g pendant trois minutes à deux degrés Celsius. Transférez le surnageant dans un nouveau microtube de 1,5 millilitre pour éliminer les débris.
Vortex le surnageant ou la fraction S1 dans un nouveau microtube de 1,5 millilitre. Pipeter immédiatement 200 microlitres de la fraction S1 dans un microtube de centrifugation et centrifuger à 100 000 G à l’aide d’un rotor TLA-55 pendant 20 minutes à deux degrés Celsius. Après la deuxième centrifugation, séparez le surnageant S2 du précipité P2.
Transférez immédiatement la totalité de la fraction S2 dans un microtube de centrifugation et utilisez un rotor TLA-120.2 pour la faire tourner à 500 000 G pendant 60 minutes à deux degrés Celsius. Après la troisième centrifugation, séparez le surnageant S3 du précipité P3. Dissoudre toute la fraction S3 dans 200 microlitres de dodécylsulfate de sodium 2X ou tampon d’échantillon SDS.
Mélangez les fractions S1 restantes avec un volume égal de tampon d’échantillon SDS 2X pour l’utiliser comme courbe standard pour le transfert Western. Ensuite, ajoutez 400 microlitres de tampon d’échantillon SDS dans les tubes de fraction P2 et P3. Ensuite, sonifiez brièvement la solution pour dissoudre le précipité avant de transférer les échantillons dans de nouveaux microtubes de 1,5 millilitre et de les placer dans la glacière.
Faites bouillir tous les échantillons à 100 degrés Celsius pendant trois minutes. Les microtubules de la fraction P2 représentaient 34,86 % de l’alpha-tubuline totale dans le cerveau d’une souris, tandis que ceux des fractions P3 et S3 représentaient respectivement 56,13 % et 9,01 %. Le pourcentage de bêta-3 tubuline dans les fractions P2, P3 et S3 n’était pas significativement différent de celui de l’alpha-tubuline.
La fraction S2 a montré un passage limité de la tubuline à travers une colonne de spin d’ultrafiltration de 300 kilodaltons, tandis que la fraction S3 a permis un passage complet des complexes de tubuline. La séparation chromatographique a donné lieu à une élution de 100 kilodaltons de tubuline S3. Des proportions égales d’alpha et de bêta-tubuline ont été récupérées dans chaque fraction.
Les fractions P2 étaient significativement enrichies en alpha-tubuline acétylée, tandis que l’alpha-tubuline tyrosinée était dominante dans la fraction P3. La congélation du cerveau avant l’homogénéisation a entraîné une diminution de la concentration d’alpha-tubuline dans les fractions P2. Cependant, l’alpha-tubuline a augmenté dans la fraction P3.
La congélation a également diminué les niveaux d’acétylation et augmenté les niveaux de tyrosination de l’alpha-tubuline dans la fraction P2. Le traitement au nocodazole a diminué l’alpha-tubuline dans la fraction P2. Contrairement à la congélation, le nocodazole n’a pas affecté les modifications post-traductionnelles de la tubuline P2.
Le tissu cérébral présentait une concentration significativement plus élevée de tubulines P2, tandis que les tubulines P3 étaient concentrées dans le tissu prolifératif. Le transfert Western a montré que la tubuline P2 spécifiquement présente dans le système nerveux provenait de microtubules stables, et que la tubuline P3 provenait de microtubules labiles. La stabilité des microtubules est très dynamique.
Il est important de compléter ce protocole rapidement, sans interruption, dans un environnement à température froide. Assurez-vous également que les tissus et les fractions n’ont pas été congelés avant d’être dissous dans le tampon d’échantillon SDS. La combinaison de la présentation immunitaire à l’aide de chaque fraction et de la protéomique devrait permettre d’identifier les facteurs impliqués dans la dynamique des microtubules.
À l’aide de cette méthode, nous avons révélé comment la protéine tau normale existe sur les microtubules. Il peut également être utilisé pour étudier comment il devient anormal dans les cerveaux âgés afin d’identifier de nouvelles cibles médicamenteuses de la démence.
