הפרוטוקול החדש שלנו מסייע להבחין ולכמת שלושה סטטוסים של טבעות צינור, כגון מיקרוטובולים יציבים, מיקרוטובולים שפתיים וצינוריות חופשיות ברקמות בעלי חיים. טכניקה זו מורכבת מצעדים פשוטים ויכולה להעריך את היציבות המבנית של הצינורות, שלא ניתן לזהות על ידי כימות של צינורות לאחר שינוי תרגומי. שיטה זו חיונית למחקר ופיתוח של דרכים טיפוליות למחלות שבהן יציבות המיקרוטובולים היא קריטית, כגון מחלת אלצהיימר וסרטן.
התחל את ההליך על ידי הכנת ללבוש מעבדה עבור דיסקציה רקמות. ממלאים קופסה בקרח כתוש ומניחים עליה שתי צלחות פטרי. מלאו צלחת אחת בתמיסת חיץ פוספט קרה כקרח או PBS לשטיפה חולפת ואחסון של רקמות מנותחות.
הניחו נייר פילטר טבול ב-PBS על המנה השנייה. לאחר מכן, לשקול את microtubes 1.5 מיליליטר מלא PBS עבור אחסון רקמות מנותחות. לאחר חילוץ הרקמות מעכבר שעבר המתת חסד, העבירו אותן לצינורות ושקלו מחדש כל מיקרו-צינור.
העבר את הרקמות לתוך הומוגנייזר זכוכית עם חיץ מייצב מיקרוטובול קר כקרח או MSB + מדיום, והומוגניזציה של הרקמה באופן מיידי באמצעות הומוגנייזר מצונן. עכשיו להעביר את הרקמה הומוגנט מיקרו שני מיליליטר באמצעות פיפטה פסטר צנטריפוגה ב 2, 400 גרם במשך שלוש דקות בשתי מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנאטנט למיקרו-צינור חדש של 1.5 מיליליטר כדי להסיר את הפסולת.
מערבול את הסופרנאטנט או את שבר S1 במיקרו-צינור חדש של 1.5 מיליליטר. מיד פיפטה 200 מיקרוליטר של חלק S1 לתוך מיקרו צינור צנטריפוגה וצנטריפוגה ב 100, 000 G באמצעות רוטור TLA-55 במשך 20 דקות בשתי מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה השנייה, הפרידו את הסופרנאטנט S2 מהמשקע P2.
מיד להעביר את כל כמות של חלק S2 לתוך microtube צנטריפוגה ולהשתמש ברוטור TLA-120.2 כדי לסובב אותו ב 500, 000 G במשך 60 דקות בשתי מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה השלישית, הפרידו את הסופרנאטנט S3 מהשקע P3. ממיסים את כל מקטע S3 ב-200 מיקרוליטר של 2X נתרן דודציל סולפט, או מאגר דגימות SDS.
ערבב את שברי S1 הנותרים עם נפח שווה של מאגר דגימות SDS 2X לשימוש כעקומה סטנדרטית עבור כתמים מערביים. לאחר מכן, הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר דגימת SDS לצינורות השבר P2 ו- P3. לאחר מכן, הפעל בקצרה את התמיסה כדי להמיס את המשקע לפני העברת הדגימות למיקרו-צינוריות חדשות של 1.5 מיליליטר והצבתן בארגז הקרח.
מרתיחים את כל הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. מיקרוטובולים במקטע P2 היוו 34.86% מכלל האלפא-טובולין במוח עכבר, בעוד שאלו בשברים P3 ו-S3 היוו 56.13% ו-9.01% בהתאמה. אחוז הטובולין בטא-3 בשברים P2, P3 ו-S3 לא היה שונה באופן משמעותי מזה של אלפא-טובולין.
שבר S2 הראה מעבר מוגבל של טובולין דרך עמוד ספין אולטרה-סינון של 300 קילודלטון, בעוד שחלק S3 איפשר מעבר מלא של קומפלקסים של טובולין. הפרדה כרומטוגרפית הביאה לפליטה של 100 קילודלטון של טובולין S3. פרופורציות שוות של אלפא ובטא-טובולין נמצאו בכל שבר.
שברי P2 הועשרו באופן משמעותי באלפא-טובולין אצטילט, בעוד שאלפא-טובולין עם טירוזין היה דומיננטי במקטע P3. הקפאת המוח לפני ההומוגניזציה גרמה לירידה בריכוז אלפא-טובולין בשברי P2. עם זאת, אלפא-טובולין גדל בחלק P3.
הקפאה גם הפחיתה את רמות האצטילציה והעלתה את רמות הטירוזינציה של אלפא-טובולין בחלק P2. הטיפול בנוקודזול הפחית אלפא-טובולין בחלק P2. בניגוד להקפאה, נוקודזול לא השפיע על השינויים שלאחר התרגום של טובולין P2.
רקמת המוח הציגה ריכוז גבוה משמעותית של טובולינים P2, בעוד שטובולינים P3 התרכזו ברקמת שגשוג. כתמים מערביים הראו כי טובולין P2 שנמצא במיוחד במערכת העצבים מקורו במיקרוטובולים יציבים, וטובולין P3 מקורו במיקרוטובולים שפתיים. יציבות מיקרוטובולים היא דינמית ביותר.
חשוב להשלים פרוטוקול זה במהירות, ללא הפרעות, בסביבת הטמפרטורה הקרה. כמו כן, ודא שהרקמות והשברים לא הוקפאו עד שהומסו במאגר דגימת SDS. שילוב של הצגה חיסונית באמצעות כל שבר עם פרוטאומיקה צפוי לזהות גורמים המעורבים בדינמיקה של מיקרוטובול.
באמצעות שיטה זו גילינו כיצד טאו נורמלי קיים על מיקרוטובולים. זה יכול לשמש גם כדי לחקור איך זה הופך להיות חריג במוחות זקנים על מנת לזהות מטרות סמים חדשות של דמנציה.
