私たちの新しいプロトコルは、動物組織における安定な微小管、不安定な微小管、遊離尿細管など、チューブリングの3つの状態を区別し、定量化するのに役立ちます。この手法は簡単なステップで構成されており、チューブの翻訳後修飾の定量化では検出できないチューブの構造安定性を評価できます。この方法は、アルツハイマー病やがんなど、微小管の安定性が重要な疾患の治療法の研究開発に不可欠です。
組織解剖用のラボウェアを準備することから手順を開始します。箱に砕いた氷を入れ、その上にペトリ皿を2つ置きます。1つの皿に氷冷したリン酸緩衝液またはPBSを充填し、解剖した組織を一過性に洗浄および保存します。
PBSで湿らせたろ紙を2皿目に置きます。次に、解剖組織保存用のPBSを充填した1.5ミリリットルのマイクロチューブを秤量します。安楽死させたマウスから組織を抽出した後、それらをチューブに移し、各マイクロチューブを再計量します。
氷冷した微小管安定化バッファーまたは MSB+培地を含むガラス製ホモジナイザーに組織を移し、チルドホモジナイザーを使用して組織を直ちにホモジナイズします。次に、パスツールピペットを使用して組織ホモジネートを2ミリリットルのマイクロチューブに移し、2, 400 Gで摂氏2度で3分間遠心分離します。上清を新しい1.5ミリリットルのマイクロチューブに移し、破片を取り除きます。
上清またはS1フラクションを新しい1.5ミリリットルのマイクロチューブにボルテックスします。すぐに200マイクロリットルのS1画分を遠心分離用マイクロチューブにピペットで移し、TLA-55ローターを使用して100, 000Gで2°Cで20分間遠心分離します。2回目の遠心分離後、S2上清をP2沈殿物から分離します。
直ちに全量のS2画分を遠心分離マイクロチューブに移し、TLA-120.2ローターを使用して、500, 000 Gで摂氏2度で60分間回転させます。3回目の遠心分離後、S3上清をP3沈殿物から分離します。S3画分全体を200マイクロリットルの2Xドデシル硫酸ナトリウム(SDSサンプルバッファー)に溶解します。
残りの S1 フラクションを等量の 2X SDS サンプルバッファーと混合し、ウェスタンブロッティングの検量線として使用します。次に、400マイクロリットルのSDSサンプルバッファーをP2およびP3フラクションチューブに添加します。次に、溶液を短時間超音波処理して沈殿物を溶解してから、サンプルを新しい1.5ミリリットルのマイクロチューブに移し、アイスボックスに入れます。
すべてのサンプルを摂氏100度で3分間煮沸します。P2画分の微小管は、マウス脳の総α-チューブリンの34.86%を占め、P3画分とS3画分の微小管は、それぞれ56.13%と9.01%を占めました。P2、P3、およびS3画分におけるβ-3チューブリンの割合は、α-チューブリンのそれと有意差はありませんでした。
S2フラクションは、300キロダルトンの限外濾過スピンカラムを通るチューブリンの通過を制限しましたが、S3フラクションはチューブリン複合体の完全な継代を可能にしました。クロマトグラフィー分離により、100 キロダルトンの S3 チューブリンが溶出しました。α-チューブリンとβ-チューブリンの比率が等しい割合で各画分で回収されました。
P2画分はアセチル化α-チューブリンで有意に濃縮され、チロシン化α-チューブリンはP3画分で優勢でした。ホモジナイズ前に脳を凍結すると、P2画分のα-チューブリン濃度が低下しました。しかし、α-チューブリンはP3画分で増加しました。
凍結はまた、アセチル化レベルを低下させ、P2画分のα-チューブリンのチロシン化レベルを上昇させた。ノコダゾール治療により、P2画分のα-チューブリンが減少しました。.凍結とは対照的に、ノコダゾールはP2チューブリンの翻訳後修飾に影響を与えませんでした。
脳組織はP2チューブリンの濃度が有意に高かったのに対し、P3チューブリンは増殖組織に集中していた。ウェスタンブロッティングにより、神経系に特異的に見られるP2チューブリンは安定な微小管に由来し、P3チューブリンは不安定な微小管に由来することが示されました。微小管の安定性は非常に動的です。
このプロトコルは、低温環境で中断することなく迅速に完了することが重要です。また、組織およびフラクションがSDSサンプルバッファーに溶解するまで凍結されていないことを確認してください。各画分を用いた免疫提示とプロテオミクスを組み合わせることで、微小管の動態に関与する因子を同定できることが期待されます。
この手法を用いて、微小管上に正常なタウがどのように存在するかを明らかにしました。また、認知症の新薬標的を特定するために、老化した脳でどのように異常になるかを研究するためにも使用できます。
