당사의 새로운 프로토콜은 동물 조직의 안정적인 미세소관, 불안정한 미세소관 및 자유 세뇨관과 같은 튜브 링의 세 가지 상태를 구별하고 정량화하는 데 도움이 됩니다. 이 기법은 간단한 단계로 구성되며 병진 변형 후 튜빙의 정량화로 검출할 수 없는 튜빙의 구조적 안정성을 평가할 수 있습니다. 이 방법은 알츠하이머병 및 암과 같이 미세소관 안정성이 중요한 질병에 대한 치료 방법의 연구 및 개발에 필수적입니다.
조직 해부를 위한 실험실 착용을 준비하여 절차를 시작합니다. 상자에 으깬 얼음을 채우고 그 위에 두 개의 페트리 접시를 놓습니다. 얼음처럼 차가운 인산염 완충 용액 또는 PBS로 접시 하나를 채우면 해부된 조직의 일시적인 세척 및 보관이 가능합니다.
두 번째 접시에 PBS를 적신 여과지를 놓습니다. 다음으로, 절개된 조직 보관을 위해 PBS로 채워진 1.5밀리리터 마이크로튜브의 무게를 잰다. 안락사된 쥐에서 조직을 추출한 후 튜브로 옮기고 각 마이크로튜브의 무게를 다시 잰다.
조직을 얼음처럼 차가운 미세소관 안정화 완충액 또는 MSB+medium이 있는 유리 균질화기로 옮기고 냉각된 균질화기를 사용하여 조직을 즉시 균질화합니다. 이제 파스퇴르 피펫과 2, 400G의 원심 분리기를 사용하여 조직 균질액을 섭씨 2도에서 3 분 동안 2 밀리리터 마이크로 튜브로 옮깁니다. 상층액을 새 1.5밀리리터 마이크로튜브로 옮겨 이물질을 제거합니다.
새로운 1.5밀리리터 마이크로튜브에서 상층액 또는 S1 분획을 소용돌이치게 합니다. 즉시 S1 분획의 200 마이크로 리터를 원심 분리 마이크로 튜브에 넣고 100, 000 G에서 TLA-55 로터를 사용하여 섭씨 2도에서 20 분 동안 원심 분리기합니다. 두 번째 원심분리 후 P2 침전물에서 S2 상층액을 분리합니다.
즉각 S2 조각의 전량을 원심분리 microtube로 옮기고 500에 회전시키도, 2 섭씨 온도에 60 분 동안 000 G를 회전시키기 위하여 TLA-120.2 회전자를 이용하십시오. 세 번째 원심분리 후 P3 침전물에서 S3 상층액을 분리합니다. 전체 S3 분획을 2X 소듐 도데실 설페이트 또는 SDS 샘플 완충액 200마이크로리터에 용해시킵니다.
나머지 S1 분획을 동일한 부피의 2X SDS 샘플 버퍼와 혼합하여 웨스턴 블로팅의 표준 곡선으로 사용합니다. 다음으로, 400 마이크로리터의 SDS 샘플 완충액을 P2 및 P3 분획 튜브에 추가합니다. 그런 다음 샘플을 새로운 1.5 밀리리터 마이크로 튜브로 옮기고 아이스 박스에 넣기 전에 용액을 간단히 초음파 처리하여 침전물을 용해시킵니다.
모든 샘플을 섭씨 100도에서 3분 동안 끓입니다. P2 분획의 미세소관은 쥐의 뇌에서 전체 알파-튜불린의 34.86%를 차지하는 반면, P3 및 S3 분획의 미세소관은 각각 56.13%와 9.01%를 차지했습니다. P2, P3 및 S3 분획에서 베타-3 튜불린의 비율은 알파-튜불린의 비율과 유의하게 다르지 않았습니다.
S2 분획은 300킬로달톤 한외여과 스핀 컬럼을 통한 튜불린의 제한된 통과를 보인 반면, S3 분획은 튜불린 복합체의 완전한 통과를 허용했습니다. 크로마토그래피 분리를 통해 S3 튜불린을 100킬로달톤 용출할 수 있었습니다. 동일한 비율의 알파 튜불린과 베타 튜불린이 각 분획에서 회수되었습니다.
P2 분획물은 아세틸화된 알파-튜불린으로 유의하게 농축된 반면, 티로신화 알파-튜불린은 P3 분획에서 우세했습니다. 균질화 전에 뇌를 얼리면 P2 분획에서 알파-튜불린 농도가 감소했습니다. 그러나 알파 튜불린은 P3 분획에서 증가했습니다.
냉동은 또한 아세틸화 수준을 감소시키고 P2 분획에서 알파-튜불린의 티로시화 수준을 증가시켰습니다. 노코다졸 처리는 P2 분획에서 알파-튜불린을 감소시켰다. 동결과 대조적으로, 노코다졸은 P2 튜불린 번역 후 변형에 영향을 미치지 않았다.
뇌 조직은 P2 튜불린의 농도가 현저히 높은 반면, P3 튜불린은 증식 조직에 집중되어 있었다. 웨스턴 블로팅(Western blotting)은 신경계에서 특이적으로 발견되는 P2 튜불린(P2 tubulin)은 안정된 미세소관(stable microtubules)에서 유래하고, P3 튜불린(P3 tubulin)은 불안정한 미세소관(microtubules)에서 유래한다는 것을 보여주었습니다. 미세소관의 안정성은 매우 동적입니다.
추운 온도 환경에서 중단 없이 이 프로토콜을 신속하게 완료하는 것이 중요합니다. 또한 조직과 분획이 SDS 샘플 완충액에 용해될 때까지 동결되지 않았는지 확인하십시오. 각 분획을 단백질체학과 사용하여 면역 발현을 결합하면 미세소관 역학과 관련된 요인을 식별할 수 있을 것으로 기대됩니다.
이 방법을 사용하여 미세소관에 정상적인 타우가 어떻게 존재하는지 밝혔습니다. 또한 치매의 새로운 약물 표적을 식별하기 위해 노화된 뇌에서 어떻게 비정상이 되는지를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
