活生物库的创建和维护 - 我们如何做到这一点

创建和维护一个活生生的生物库， 我们如何做到这一点。介绍。传统的生物库通常含有不可行的组织和血液样本。尽管充分反映了癌症患者群体的多样性，并允许进行遗传和组织学分析，但它们不适合临床前分析评估治疗策略。

生物库集成了患者衍生的模型，克服了这些限制。从而实现精密医学的功能测试。样本采集。

对于结肠直肠癌和胰腺癌的生物库，选择诊断证明良好且肿瘤大小充足的病例，必须告知患者的浓缩物。手术开始前，使用肝素化注射器抽取20毫升血液，并用血清单体注射7.5毫升。血清处理和 PBL 隔离。

在1，128 RCF离心15分钟后，血清在四度被引用在预先标记的低温管中，并直接浸入液氮中。肝素化血液被转移到聚丙烯管中，用15ml PBS稀释。使用血清学移液器将混合物慢慢与 15ml Pancoll 混合。

密度梯度离心后，含有单核细胞的不透明层被用血清移液器占用，并转移到新的PP管中。用PBS清洗后，通过离心清洗单核细胞，丢弃超核物，在冷冻介质中重新插入颗粒，并分配到预先标记的低温管中。将管子转移到适合每分钟一度缓慢冷冻的冷却容器中，并临时存放在 80 度。

组织处理。外科医生一切除组织标本，就将其放入合适的容器中。避免在任何情况下，组织覆盖在形式素。

尽快输送到肿瘤材料切除的病理学中，与切除边缘的病理评估无关。肿瘤片应尽可能处理。此外，获得健康组织的标本，并将两者放在冰上预加组织储存溶液的单独管中。

立即返回实验室，在无菌条件下开始组织处理。组织片被放置在一个无菌塑料盘上，里面装满了组织储存溶液，以避免干燥。首先，根据获得的组织标本的大小，对一个或多个针头大小的碎片进行快速冷冻。

将原生组织放入预先标记的低温管中，并立即浸入液氮中。将剩余的组织切成三乘三立方毫米的立方体。考虑到坏死组织必须完全解剖，但不应丢弃。

将立方体排列为四倍，以确定重要存储的阿里报价数量。标记足够数量的低温管，并预填充它们与1.5毫升冰柜介质每个。由于冷冻介质中的DMSO是细胞毒性的，所以可以快速、不间断地执行后续步骤。

使用手术刀刀片每管挖出四块组织件。确保所有部件完全浸入管底部的冰柜介质中，并使用冷冻容器快速冷冻管。以同样的方式进行健康标本。

对于长期存储，将所有别名存储在液氮罐中。细胞培养。研磨肿瘤组织处理的残留物，包括尽可能小的手术刀片的坏死部分。

将细胞过滤器放在无菌 PP 管的顶部，然后用血清移液器吸气悬架通过细胞过滤器。使用单次使用注射器的柱塞通过细胞过滤器按下组织残留物，以产生单个细胞悬架。用 PBS 冲洗并重复这些步骤，直到没有剩余材料。

取出细胞过滤器，将悬架在 180 RCF 上离心7分钟。同时，准备一个胶原蛋白预涂层的六井板，具有不同的介质成分，以增加肿瘤生长的概率。丢弃超细剂，在PBS中补充颗粒，每口井分配500微升。

之后，将盘子放在标准孵化器中。患者衍生的异种移植的生成。对于免疫功能低下的小鼠中患者衍生的异种移植物的生成，动物应保存在特定的无病原体环境中。

佩戴由磨砂、围裙、面罩、护发罩和手套组成的个人防护装备。安排工作空间后，从液氮容器中取出欲望肿瘤标本。用 35ml PBS 填充新鲜的 PP 管，然后小心地清洗解冻过程，向上和向下倾斜冷冻管。

一旦内容变得泥泞，倒入PBS和冲洗肿瘤片。丢弃大部分 PBS 并将立方体倒入盖子中。将无菌塑料盘放在冰袋上，并加入100微升矩阵。

使用钳子将肿瘤片放在母体中，并孵育肿瘤10分钟。同时，麻醉两只老鼠。捏住动物的脚来检查麻醉的深度。

任何运动都表示麻醉不足，需要等待或补充剂。涂上眼药膏，捏住老鼠的脖子，皮下注射微芯片。并行执行以下步骤。

对老鼠的侧翼进行消毒，用条纹梅森鲍姆剪刀做一个小皮肤切口，并通过钝制剂形成皮下口袋。使用解剖钳插入肿瘤片。确保该件放在皮肤口袋的后端。

吸气剩余的马特里格尔，并平等地分配给所有四个口袋。等待凝胶的固化，用单个按钮缝合关闭皮肤，而不会用针头损坏肿瘤片。在结上方尽可能缩短螺纹，并涂抹喷雾敷料以防止缝合线的结。

扫描微芯片，并将肿瘤信息添加到数据库中，以便以后识别动物。准备一个笼子与新鲜的床上用品和筑巢材料，把老鼠放在红外灯前，并监测动物，直到麻醉消退。PDX 的去除。

PDX肿瘤达到规定大小后，小鼠通过二氧化碳窒息和随后的宫颈错位进行安乐死。仔细解剖肿瘤的皮肤，并完全切除PDX。代表性结果。

将肿瘤放在无菌塑料盘上，使用无菌手术刀片进行进一步加工。用切片切开孔，放入病理学盒中，并浸入形式素中，生成石蜡嵌入标本，以便日后进行组学评估。将肿瘤的其余部分转移到组织储存溶液中，为生物库创建新的重要保存和捕捉冷冻标本。

此外，使用类似于章细胞培养的PDX肿瘤的残留物来建立继发性肿瘤细胞系。为了生成进一步的PDX，将两个或两个以上的肿瘤片段与Matrigel转移到一个新的接收鼠标，如前所示。结论。通过介绍的协议，我们迄今已建立了9个胰腺和100多个结肠直肠患者衍生的癌细胞系，以及19个胰腺和150多个结肠直肠PDX模型。