GFP标记的光感受器蛋白，如离子通道TRPL GFP，使我们能够使用无创技术研究神经元中的蛋白质转运。该方法也可用于监测光感受器变性。因此，可以在果蝇眼中研究导致人类失明的遗传性疾病的分子基础。
GFP标记蛋白的细胞定位可以通过观察深部假腮或水浸显微镜中的荧光来评估。这两种方法都可以快速确定视觉蛋白的定位，并观察由于光感受器细胞变性而导致的横纹肌的结构缺陷。要获得高质量的图像，最重要的方面是苍蝇眼的方向。
在执行这种技术时，应该关注位于眼睛周围稍微靠近的卵形。我将演示DPP成像的程序，而使用水浸显微镜的两种技术将由我的同事Krystina Wagner博士和我们小组的博士生Matthias Zeger演示。要开始深部假性苍蝇或DPP成像，麻醉一到三天的苍蝇，并将其中一只置于显微镜物镜中心，使其侧面，以便左眼或右眼精确地径向物镜。
增加放大倍率以适合整个眼睛，并将眼睛的中央眼睑居中。如果可能，通过将双光圈振膜调整到浅设置来减小显微镜的景深。接下来，以最大强度打开显微镜紫外灯。
然后，根据眼睛中表达的荧光蛋白选择显微镜的荧光滤光片组，并设置朝向显微镜安装的相机的光路。使用软件中的实时成像功能，通过提高曝光时间和增益值，将图像亮度调整为仅检测来自眼睛的特定信号的设置。将显微镜焦点重新调整到眼睛中，以生成DPP的叠加图像。
然后，拍摄荧光DPP的快照。为了准备致命变化的苍蝇，将一块橡皮泥粘在物体载玻片上，另一块粘在培养皿的中心。在培养皿中加入冰冷的蒸馏水和一些冰片。
然后，将一只冰麻醉的苍蝇放在橡皮泥涂层物体载玻片顶部的体视显微镜下。转动苍蝇的背部，刺穿昆虫针穿过胸部中心。将销钉水平固定在涂有橡皮泥的物体滑块上，并将苍蝇的左眼或右眼向上定向。
然后，小心地将物体滑块固定在培养皿中，使其无橡皮泥的一面朝下，防止苍蝇头旋转。确保苍蝇的眼睛被水覆盖。或者，为了准备非致命变化的苍蝇，首先将冰麻醉的苍蝇头转移到200微升的移液器吸头中，然后用压缩空气小心地将苍蝇推向尖端。
然后，使用手术刀，切掉头部正前方的移液器尖端，然后用镊子小心地将苍蝇推入移液器尖端几毫米。再次切断移液器吸头，并用压缩空气将苍蝇推回吸头，以便只有苍蝇的头部从移液器吸头突出。将一块橡皮泥粘在物体载玻片上后，将移液器尖端按入其中，使左眼或右眼朝上。
确保眼睛在显微镜下方向正确。对于图像采集，请选择水浸物镜。在非致命变异的情况下，使用实验室移液器将一大滴冷冻水粘附到水浸物镜的底面。
小心地将装有准备好的苍蝇的物体载玻片放在显微镜载物台上。然后，手动降低水浸物镜，直到它接触到水面或苍蝇的眼睛接触到水滴。然后，将光路切换到显微镜相机，并生成实时图像。
重新调整相机的焦点，并评估眼睛的方向，考虑到眼睛必须径向面对显微镜物镜。使用查找表软件检测过饱和。对于无色素的苍蝇，请调整曝光时间，使最亮的像素略低于每个图像的饱和度限制。
记录图像，并将其另存为原始文件以存档记录的所有相应元数据。然后，以 tif 格式导出图像。要量化水浸式显微照片的横纹肌中的相对eGFP荧光，请通过单击“分析”和“设置测量值”来调整ImageJ设置，并仅选中“平均灰度值”框。
通过单击“文件”导入tif图像，然后单击“打开”。选择图像的代表性区域，并通过反复按下Control并一起将其放大到200%至300%。接下来，选择椭圆形工具，并在按 Shift 键的同时，在图像中生成一个明显小于一个荧光横纹肌的圆形选区。
然后，查找 ImageJ 主窗口中工具栏下方显示的确切大小。要测量圆形选区中的荧光强度，请使用键盘上的箭头键将圆圈移动到第一个横纹肌，然后单击“分析”，然后单击“测量”。将弹出一个结果窗口，其中列出了测量的灰度值。
继续测量横纹肌二到六，并测量背景信号。在无色素苍蝇的情况下，对相应的细胞体区域进行额外的测量。测量另外两个ommatidia的荧光，从而产生三个技术重复。
使用铅笔工具标记分析的 ommatidia，并保存此图像以供文档记录。从结果窗口中选择并复制测量的灰度值，然后将其粘贴到电子表格软件中以进行进一步计算。将荧光强度值根据其来源分类为横纹肌，细胞体和背景类别，并计算每个类别的平均强度。
然后，使用第一个公式计算横纹肌中存在的eGFP的相对量，第二个公式用于无色素的眼睛，第二个公式用于有色素的眼睛。或者，为了在水浸显微照片中通过eGFP荧光量化眼睛形态，请在聚焦图像的代表性区域中选择三个相邻的ommatidia。根据其eGFP强度，边缘清晰度以及与周围背景信号的对比度，分别评估所选的18个横纹肌。
最后，对清晰可见的横纹肌进行评分，值为2，每周可见的横纹肌值为1，缺失的横纹肌值为零，以生成退化指数。在表达eGFP TRPL融合蛋白的转基因果蝇中，由于eGFP TRPL的易位，横纹体荧光在光照下消失。这允许进行遗传筛选以识别在eGFP TRPL内化中存在缺陷的突变体。
在对照蝇中，eGFP TRPL在照明16小时后从横纹肌易位到细胞体内，与黑暗适应状态相比，横纹肌荧光显着降低。第二次暗孵育将横纹体荧光再次提高到初始值。然而，在TRPL易位缺陷突变体vps35MH20中，荧光图案在照明16小时和随后的24小时黑暗适应后不会发生巨大变化。
这种量化方法可以检测出具有统计意义的回收缺陷。白眼苍蝇可以检测来自横纹肌和细胞体的荧光信号。相比之下，在红眼苍蝇中，荧光信号只能在横纹肌中检测到，但在细胞体内却不能检测到。
关于视网膜变性的定量，可以在几周内评估eGFP TRP荧光。当保持在12小时的光照，12小时的黑暗周期中两周时，突变苍蝇的退化指数下降，但不能控制苍蝇。在这个协议中，需要区分有色和非色素的眼睛。
由于色素沉着会影响荧光信号，因此定量水浸显微镜已针对这两种情况进行了单独优化。DPP成像和水浸显微镜是分辨率有限的高通量方法。为了研究亚细胞定位，我们建议在组织切片上进行免疫荧光显微镜检查。
为了详细分析退行性表型，可以进行电子显微镜检查。
