Las proteínas fotorreceptoras marcadas con GFP, como el canal iónico TRPL GFP, nos permiten estudiar el transporte de proteínas en las neuronas utilizando técnicas no invasivas. Este método también se puede utilizar para controlar la degeneración de los fotorreceptores. Por lo tanto, la base molecular de las enfermedades hereditarias que resultan en ceguera en humanos se puede estudiar en el ojo de Drosophila.
La localización celular de proteínas marcadas con GFP se puede evaluar observando la fluorescencia en el pseudopúplo profundo o mediante microscopía de inmersión en agua. Ambos métodos permiten determinar rápidamente la localización de proteínas visuales y observar defectos estructurales de rabdomeros debido a la degeneración de las células fotorreceptoras. Para obtener imágenes de alta calidad, el aspecto más importante es la orientación del ojo de mosca.
Al realizar esta técnica, uno debe centrarse en los ommatidios ubicados ligeramente hacia la periferia del ojo. Demostraré el procedimiento de imágenes DPP, mientras que las dos técnicas que utilizan microscopía de inmersión en agua serán demostradas por mi colega, la Dra. Krystina Wagner, y Matthias Zeger, un estudiante de doctorado en nuestro grupo. Para comenzar las imágenes profundas de pseudopúpido, o DPP, anestesia las moscas de uno a tres días de edad, y coloca una de ellas en el centro del objetivo del microscopio de lado para que el ojo izquierdo o derecho esté mirando hacia el objetivo con precisión radialmente.
Aumente la ampliación para que se ajuste a todo el ojo y centre los ommatidios centrales del ojo. Si es posible, disminuya la profundidad de campo del microscopio ajustando el diafragma de doble iris a un ajuste poco profundo. A continuación, encienda la lámpara UV del microscopio a máxima intensidad.
Luego, seleccione el conjunto de filtros de fluorescencia del microscopio de acuerdo con la proteína de fluorescencia expresada en los ojos y establezca la trayectoria de la luz hacia la cámara montada en el microscopio. Usando la función de imágenes en vivo dentro del software, ajuste el brillo de la imagen a una configuración que detecte solo señales específicas del ojo al aumentar el tiempo de exposición y ganar valor. Reajuste el foco del microscopio en el ojo para generar la imagen superpuesta del DPP.
Luego, tome una instantánea del DPP fluorescente. Para preparar una mosca en una variación letal, adhiera un trozo de plastilina en un portaobjetos de objeto y otro trozo en el centro de una placa de Petri. Llene la placa de Petri con agua destilada helada y algunos copos de hielo.
Luego, coloque una mosca anestesiada con hielo bajo un microscopio estereoscópico en la parte superior del portaobjetos recubierto de plastilina. Gire la mosca sobre su espalda y perfore un alfiler de insecto a través del centro del tórax. Fije el pasador horizontalmente en la diapositiva del objeto recubierto de plastilina y oriente el ojo izquierdo o derecho de la mosca hacia arriba.
Luego, fije cuidadosamente la corredera del objeto con su lado libre de plastilina hacia abajo en la placa de Petri, evitando la rotación de la cabeza de la mosca. Asegúrese de que el ojo de mosca esté cubierto de agua. Alternativamente, para preparar una mosca en una variación no letal, transfiera la mosca anestesiada con hielo de cabeza a una punta de pipeta de 200 microlitros y empuje cuidadosamente la mosca hacia la punta con aire comprimido.
Luego, usando un bisturí, corte la punta de la pipeta justo en frente de la cabeza y, con pinzas, empuje cuidadosamente la mosca unos milímetros en la punta de la pipeta. Corte la punta de la pipeta nuevamente y empuje la mosca hacia la punta con el aire comprimido para que solo la cabeza de la mosca sobresalga de la punta de la pipeta. Después de adherir un trozo de plastilina en un portaobjetos de objeto, presione la punta de la pipeta en él para que el ojo izquierdo o derecho mire hacia arriba.
Asegúrese de que el ojo esté orientado correctamente bajo el microscopio. Para la adquisición de imágenes, seleccione un objetivo de inmersión en agua. En el caso de una variación no letal, use una pipeta de laboratorio para adherir una gran gota de agua fría a la parte inferior del objetivo de inmersión en agua.
Coloque cuidadosamente el portaobjetos del objeto con la mosca preparada en el escenario del microscopio. Luego, baje el objetivo de inmersión en agua manualmente hasta que entre en contacto con la superficie del agua o el ojo de la mosca toque la gota. Luego, cambie la trayectoria de la luz hacia la cámara del microscopio y genere una imagen en vivo.
Reajuste el enfoque para la cámara, y evalúe la orientación del ojo, considerando que el ojo debe mirar radialmente hacia el objetivo del microscopio. Utilice el software de tabla de búsqueda para detectar la sobresaturación. En el caso de moscas no pigmentadas, ajuste el tiempo de exposición de modo que los píxeles más brillantes estén justo por debajo del límite de saturación para cada imagen.
Grabe una imagen y guárdela como un archivo sin procesar para archivar todos los metadatos correspondientes de la grabación. A continuación, exporte la imagen en formato tif. Para cuantificar la fluorescencia relativa de eGFP en los rabdomeros de las micrografías de inmersión en agua, ajuste la configuración de ImageJ haciendo clic en Analizar, luego en Establecer mediciones y marque solo la casilla valor gris medio.
Importe la imagen tif haciendo clic en Archivo y, a continuación, en Abrir. Elija una región representativa de la imagen en foco y amplíela al 200 al 300% presionando repetidamente Control y juntos. A continuación, seleccione la herramienta Óvalo y, al presionar la tecla Mayús, genere una selección circular en la imagen que sea significativamente más pequeña que un rabdomero fluorescente.
Luego, busque el tamaño exacto que se muestra debajo de la barra de herramientas en la ventana principal de ImageJ. Para medir las intensidades de fluorescencia dentro de la selección circular, mueva el círculo al primer rabdomero con las teclas de flecha del teclado y haga clic en Analizar y, a continuación, en Medir. Aparecerá una ventana de resultados que enumera el valor gris medido.
Continúe con las mediciones de rabdomeros de dos a seis, y también mida la señal de fondo. En el caso de moscas no pigmentadas, realice mediciones adicionales de las áreas del cuerpo celular correspondientes. Mida la fluorescencia de dos ommatidios más, lo que resulta en tres réplicas técnicas.
Marque los ommatidios analizados mediante la herramienta Lápiz y guarde esta imagen para la documentación. Seleccione y copie los valores grises medidos desde la ventana de resultados y péguelos en el software de hoja de cálculo para realizar cálculos adicionales. Ordene los valores de intensidad de fluorescencia según su origen en las categorías rabdomere, cuerpo celular y fondo, y calcule la intensidad media de cada categoría.
Luego, calcule la cantidad relativa de eGFP presente en el rabdomero utilizando la primera fórmula para ojos no pigmentados y la segunda para ojos pigmentados. Alternativamente, para cuantificar la morfología ocular mediante fluorescencia eGFP en micrografías de inmersión en agua, elija tres ommatidios adyacentes en una región representativa de la imagen que está enfocada. Evalúe los 18 rabdomeros de la selección individualmente de acuerdo con su intensidad eGFP, nitidez de borde y contraste con respecto a la señal de fondo circundante.
Finalmente, puntúe los rabdomeros claramente visibles con un valor de dos, los rabdomeros visibles semanales con un valor de uno y los rabdomeros ausentes con un valor de cero para generar un índice de degeneración. En las moscas transgénicas de Drosophila que expresan una proteína de fusión eGFP TRPL, la fluorescencia rabdomeral desaparece en la luz debido a la translocación de la TRPL eGFP. Esto permite realizar un cribado genético para identificar mutantes defectuosos en la internalización de la eGFP TRPL.
En las moscas de control, eGFP TRPL se transloca de los rabdomeros al cuerpo celular después de 16 horas de iluminación, lo que resulta en una disminución significativa de la fluorescencia rabdomeral en comparación con el estado adaptado a la oscuridad. La segunda incubación oscura eleva la fluorescencia rabdomeral de nuevo hacia el valor inicial. Sin embargo, en la translocación TRPL mutante defectuoso vps35MH20, el patrón de fluorescencia no cambia drásticamente después de 16 horas de iluminación y una posterior adaptación a la oscuridad durante 24 horas.
Este método de cuantificación puede detectar un defecto de reciclaje estadísticamente altamente significativo. Las moscas de ojos blancos permiten la detección de señales de fluorescencia tanto del rabdomero como del cuerpo celular. En contraste, en las moscas de ojos rojos, las señales de fluorescencia solo son detectables en rabdomeros, pero no en el cuerpo celular.
Con respecto a la cuantificación de la degeneración de la retina, la fluorescencia eGFP TRP se puede evaluar en el transcurso de varias semanas. Cuando se mantuvo en un ciclo de oscuridad de 12 horas de luz y 12 horas durante dos semanas, el índice de degeneración disminuyó en las moscas mutantes, pero no en las moscas de control. En este protocolo, uno necesita diferenciar entre ojos pigmentados y no pigmentados.
Dado que la pigmentación afecta a la señal fluorescente, la microscopía cuantitativa de inmersión en agua se ha optimizado para ambos casos individualmente. Las imágenes DPP y la microscopía de inmersión en agua son métodos de alto rendimiento con resolución limitada. Para investigar la localización subcelular, se recomienda la microscopía de inmunofluorescencia en secciones de tejido.
Para un análisis detallado de los fenotipos degenerativos, se puede realizar microscopía electrónica.
