Proteínas fotorreceptoras marcadas por GFP, como o canal de íonS TRPL GFP, permitem estudar o transporte de proteínas em neurônios usando técnicas não invasivas. Este método também pode ser usado para monitorar a degeneração do fotorreceptor. Assim, a base molecular de doenças hereditárias que resultam em cegueira em humanos pode ser estudada no olho de Drosophila.
A localização celular de proteínas marcadas por GFP pode ser avaliada observando a fluorescência no pseudopupil profundo ou por microscopia de imersão na água. Ambos os métodos permitem a rápida determinação da localização de proteínas visuais e a observação de defeitos estruturais de rabdomeres devido à degeneração das células fotorreceptoras. Para obter imagens de alta qualidade, o aspecto mais importante é a orientação do olho mosca.
Ao executar esta técnica, deve-se focar na ommatidia localizada ligeiramente em direção à periferia do olho. Demonstrarei o procedimento de imagem DPP, enquanto as duas técnicas que utilizam microscopia de imersão hídrica serão demonstradas pela minha colega, Dra. Para começar o pseudopupil profundo, ou DPP, imagem, anestesiar moscas de um a três dias de idade, e posicionar uma delas no centro do objetivo do microscópio em seu lado para que o olho esquerdo ou direito esteja voltado precisamente para o objetivo.
Aumente a ampliação para caber o olho inteiro, e centralizar a ommatidia central do olho. Se possível, diminua a profundidade de campo do microscópio ajustando o diafragma de íris dupla para um ajuste raso. Em seguida, ligue a lâmpada UV do microscópio em intensidade máxima.
Em seguida, selecione o conjunto de filtro de fluorescência do microscópio de acordo com a proteína de fluorescência expressa nos olhos, e defina o caminho leve em direção à câmera montada no microscópio. Usando o recurso de imagem ao vivo dentro do software, ajuste o brilho da imagem para uma configuração que detecta apenas sinais específicos do olho, elevando o tempo de exposição e ganhando valor. Reajustar o foco do microscópio no olho para gerar a imagem sobreposta do DPP.
Em seguida, tire uma foto do DPP fluorescente. Para preparar uma mosca em uma variação letal, adere um pedaço de Plasticine em um slide de objeto e outro pedaço no centro de uma placa de Petri. Encha a placa de Petri com água destilada gelada e alguns flocos de gelo.
Em seguida, coloque uma mosca anestesizada de gelo sob um microscópio estéreo em cima do slide de objeto revestido de plasticina. Vire a mosca de costas, e fure um pino de inseto pelo centro do tórax. Fixar o pino horizontalmente no slide do objeto revestido de plasticine e orientar o olho esquerdo ou direito da mosca para cima.
Em seguida, fixar cuidadosamente o slide do objeto com seu lado livre de plasticine voltado para baixo na placa de Petri, impedindo a rotação da cabeça de mosca. Certifique-se de que o olho de mosca está coberto de água. Alternativamente, para preparar uma mosca em uma variação não letal, transfira a cabeça de mosca anestriizada por gelo primeiro em uma ponta de pipeta de 200 microliter, e empurre cuidadosamente a mosca em direção à ponta com ar comprimido.
Em seguida, usando um bisturi, corte a ponta da pipeta bem na frente da cabeça, e usando pinças empurre cuidadosamente a mosca alguns milímetros para dentro da ponta pipeta. Corte a ponta da pipeta novamente, e empurre a mosca de volta para a ponta com o ar comprimido para que apenas a cabeça da mosca se saliente da ponta pipeta. Depois de aderir um pedaço de Plasticine em um slide de objeto, pressione a ponta da pipeta nele para que o olho esquerdo ou direito fique de frente para cima.
Certifique-se de que o olho está orientado corretamente sob o microscópio. Para aquisição de imagens, selecione um objetivo de imersão em água. No caso de uma variação não letal, use uma pipeta de laboratório para aderir a uma grande gota de água gelada na parte inferior do objetivo de imersão hídrica.
Coloque cuidadosamente o slide do objeto com a mosca preparada no estágio do microscópio. Em seguida, abaixe o objetivo de imersão em água manualmente até que entre em contato com a superfície da água ou o olho da mosca toque a gota. Em seguida, mude o caminho da luz em direção à câmera do microscópio e gere uma imagem ao vivo.
Reajuste o foco para a câmera, e avalie a orientação do olho, considerando que o olho deve enfrentar o microscópio objetivo radialmente. Use o software de tabela de procuração para detectar a supersaturação. No caso de moscas não pigmentadas, ajuste o tempo de exposição de modo que os pixels mais brilhantes estejam logo abaixo do limite de saturação para cada imagem.
Grave uma imagem e salve-a como um arquivo bruto para arquivar todos os metadados correspondentes da gravação. Em seguida, exporte a imagem em formato tif. Para quantificar a fluorescência relativa eGFP nos rabdomeros dos micrografos de imersão de água, ajuste as configurações do ImageJ clicando em Analisar, em seguida, definir medidas e verificar apenas a caixa para significar valor cinza.
Importe a imagem do tif clicando em Arquivo e, em seguida, Abra. Escolha uma região representativa da imagem em foco e amplie-a para 200 a 300%, pressionando repetidamente o Controle e juntos. Em seguida, selecione a ferramenta Oval e, ao pressionar a tecla Shift, gere uma seleção circular na imagem significativamente menor que um rabdomero fluorescente.
Em seguida, procure o tamanho exato exibido abaixo da barra de ferramentas na janela principal ImageJ. Para medir as intensidades de fluorescência dentro da seleção circular, mova o círculo para o primeiro rabdomero com as teclas de seta no teclado e clique em Analisar, em seguida, Mexa. Uma janela de resultado listando o valor cinza medido aparecerá.
Continue com medições de rabdomeres de dois a seis, e também meça o sinal de fundo. No caso de moscas não pigmentadas, faça medições adicionais das áreas correspondentes do corpo celular. Meça a fluorescência de mais duas ommatidia, resultando em três réplicas técnicas.
Marque a ommatidia analisada usando a ferramenta Lápis e salve esta imagem para documentação. Selecione e copie os valores cinzentos medidos da janela de resultado e cole-os em software de planilha para cálculos adicionais. Classifique os valores de intensidade de fluorescência de acordo com sua origem nas categorias rabdomere, corpo celular e fundo, e calcule a intensidade média de cada categoria.
Em seguida, calcule a quantidade relativa de eGFP presente no rabdomere utilizando a primeira fórmula para olhos não pigmentados e a segunda para olhos pigmentados. Alternativamente, para quantificar a morfologia dos olhos pela fluorescência eGFP em micrografos de imersão em água, escolha três ommatidia adjacentes em uma região representativa da imagem que está em foco. Avalie os 18 rhabdomeres da seleção individualmente de acordo com sua intensidade eGFP, nitidez da borda e contraste com relação ao sinal de fundo circundante.
Por fim, escorra os rabdomeros claramente visíveis com um valor de dois rabdomers visíveis semanais com um valor de um, e rabdomers ausentes com um valor de zero para gerar um índice de degeneração. Em moscas transgênicas de Drosophila expressando uma proteína de fusão eGFP TRPL, a fluorescência rabdomeral desaparece à luz devido à translocação do eGFP TRPL. Isso permite a realização de uma tela genética para identificar mutantes defeituosos na internalização do eGFP TRPL.
Em moscas de controle, o eGFP TRPL transloca-se para fora dos rabdomers para o corpo celular após 16 horas de iluminação, resultando em uma diminuição significativa da fluorescência rabdomeral em comparação com o estado adaptado à escuridão. A segunda incubação escura eleva novamente a fluorescência rabdomeral em direção ao valor inicial. No entanto, na translocação TRPL defelocação mutante defetiva vps35MH20, o padrão de fluorescência não muda drasticamente após 16 horas de iluminação e uma adaptação escura subsequente por 24 horas.
Este método de quantificação pode detectar um defeito de reciclagem estatisticamente altamente significativo. Moscas de olhos brancos permitem a detecção de sinais de fluorescência tanto do rhabdomere quanto do corpo celular. Em contraste, em moscas de olhos vermelhos, sinais de fluorescência só são detectáveis em rabdomers, mas não no corpo celular.
Quanto à quantificação da degeneração da retina, a fluorescência eGFP TRP pode ser avaliada ao longo de várias semanas. Quando mantido em um ciclo escuro de 12 horas e luz por duas semanas, o índice de degeneração diminuiu em moscas mutantes, mas não em moscas de controle. Neste protocolo, é preciso diferenciar entre olhos pigmentados e não pigmentados.
Uma vez que a pigmentação afeta o sinal fluorescente, a microscopia quantitativa de imersão em água tem sido otimizada para ambos os casos individualmente. As imagens DPP e a microscopia de imersão na água são métodos de alta produtividade com resolução limitada. Para investigar a localização subcelular, recomendamos microscopia de imunofluorescência em seções teciduais.
Para uma análise detalhada de fenótipos degenerativos, a microscopia eletrônica pode ser realizada.
