Le proteine fotorecettrici con tag GFP, come il canale ionico TRPL GFP, ci consentono di studiare il trasporto proteico nei neuroni utilizzando tecniche non invasive. Questo metodo può anche essere utilizzato per monitorare la degenerazione dei fotorecettori. Pertanto, le basi molecolari delle malattie ereditarie con conseguente cecità negli esseri umani possono essere studiate nell'occhio di Drosophila.
La localizzazione cellulare delle proteine marcate con GFP può essere valutata osservando la fluorescenza nello pseudopupil profondo o mediante microscopia ad immersione in acqua. Entrambi i metodi consentono una rapida determinazione della localizzazione delle proteine visive e l'osservazione dei difetti strutturali dei rabdomeri dovuti alla degenerazione delle cellule fotorecettrici. Per ottenere immagini di alta qualità, l'aspetto più importante è l'orientamento dell'occhio di mosca.
Durante l'esecuzione di questa tecnica, ci si dovrebbe concentrare su ommatidi situati leggermente verso la periferia dell'occhio. Dimostrerò la procedura di imaging DPP, mentre le due tecniche che utilizzano la microscopia ad immersione in acqua saranno dimostrate dalla mia collega, la dott.ssa Krystina Wagner, e Matthias Zeger, uno studente di dottorato nel nostro gruppo. Per iniziare l'imaging profondo di pseudopupil, o DPP, anestetizzare mosche da uno a tre giorni e posizionarne una al centro dell'obiettivo del microscopio su un lato in modo che l'occhio sinistro o destro sia rivolto verso l'obiettivo esattamente radialmente.
Aumentare l'ingrandimento per adattarsi all'intero occhio e centrare l'ommatidi centrale dell'occhio. Se possibile, ridurre la profondità di campo del microscopio regolando il diaframma a doppia iride su un'impostazione poco profonda. Quindi, accendere la lampada UV del microscopio alla massima intensità.
Quindi, selezionare il set di filtri di fluorescenza del microscopio in base alla proteina di fluorescenza espressa negli occhi e impostare il percorso della luce verso la fotocamera montata sul microscopio. Utilizzando la funzione di imaging dal vivo all'interno del software, regolare la luminosità dell'immagine su un'impostazione che rileva solo segnali specifici dall'occhio aumentando il tempo di esposizione e guadagnando valore. Riregolare la messa a fuoco del microscopio nell'occhio per generare l'immagine sovrapposta del DPP.
Quindi, scatta un'istantanea del DPP fluorescente. Per preparare una mosca in una variante letale, far aderire un pezzo di plastilina su una diapositiva di un oggetto e un altro pezzo al centro di una capsula di Petri. Riempire la capsula di Petri con acqua distillata ghiacciata e alcuni fiocchi di ghiaccio.
Quindi, metti una mosca anestetizzata dal ghiaccio sotto uno stereomicroscopio sopra il vetrino dell'oggetto rivestito di plastilina. Gira la mosca sulla schiena e perfora una spilla da insetto attraverso il centro del torace. Fissare il perno orizzontalmente sulla diapositiva dell'oggetto rivestito in plastilina e orientare l'occhio sinistro o destro della mosca verso l'alto.
Quindi, fissare con cura la diapositiva dell'oggetto con il suo lato privo di plastilina rivolto verso il basso nella capsula di Petri, impedendo la rotazione della testa della mosca. Assicurarsi che l'occhio della mosca sia coperto d'acqua. In alternativa, per preparare una mosca in una variante non letale, trasferire prima la testa di mosca anestetizzata dal ghiaccio in una punta di pipetta da 200 microlitri e spingere con attenzione la mosca verso la punta con aria compressa.
Quindi, usando un bisturi, tagliare la punta della pipetta proprio davanti alla testa e usando una pinzetta spingere con attenzione la mosca di alcuni millimetri nella punta della pipetta. Tagliare di nuovo la punta della pipetta e spingere la mosca indietro verso la punta con l'aria compressa in modo che solo la testa della mosca sporga dalla punta della pipetta. Dopo aver aderito un pezzo di plastilina su una diapositiva di oggetto, premere la punta della pipetta in modo che l'occhio sinistro o destro sia rivolto verso l'alto.
Assicurarsi che l'occhio sia orientato correttamente al microscopio. Per l'acquisizione delle immagini, selezionare un obiettivo di immersione in acqua. Nel caso di una variazione non letale, utilizzare una pipetta da laboratorio per far aderire una grande goccia di acqua refrigerata sul lato inferiore dell'obiettivo di immersione in acqua.
Posizionare con attenzione il vetrino dell'oggetto con la mosca preparata sul palco del microscopio. Quindi, abbassare manualmente l'obiettivo di immersione in acqua fino a quando non entra in contatto con la superficie dell'acqua o l'occhio della mosca tocca la goccia. Quindi, cambia il percorso della luce verso la fotocamera del microscopio e genera un'immagine dal vivo.
Riregolare la messa a fuoco per la fotocamera e valutare l'orientamento dell'occhio, considerando che l'occhio deve essere rivolto verso l'obiettivo del microscopio radialmente. Utilizzare il software della tabella di ricerca per rilevare la sovrasaturazione. Nel caso di mosche non pigmentate, regolare il tempo di esposizione in modo che i pixel più luminosi siano appena al di sotto del limite di saturazione per ogni immagine.
Registrare un'immagine e salvarla come file raw per archiviare tutti i metadati corrispondenti della registrazione. Quindi, esporta l'immagine in un formato tif. Per quantificare la fluorescenza eGFP relativa nei rhabdomere delle micrografie ad immersione in acqua, regolare le impostazioni imageJ facendo clic su Analizza, quindi su Imposta misurazioni e selezionare solo la casella Valore grigio medio.
Importa l'immagine tif facendo clic su File, quindi su Apri. Scegliere un'area rappresentativa dell'immagine a fuoco e ingrandirla al 200-300% premendo ripetutamente Ctrl e insieme. Quindi, selezionare lo strumento Ovale e, mentre si preme il tasto Maiusc, generare una selezione circolare nell'immagine che è significativamente più piccola di un rabdomere fluorescente.
Quindi, cerca la dimensione esatta visualizzata sotto la barra degli strumenti nella finestra principale di ImageJ. Per misurare le intensità di fluorescenza all'interno della selezione circolare, spostare il cerchio sul primo rabdomere con i tasti freccia sulla tastiera e fare clic su Analizza, quindi su Misura. Verrà visualizzata una finestra dei risultati che elenca il valore grigio misurato.
Continua con le misurazioni dei rabdomeri da due a sei e misura anche il segnale di fondo. Nel caso di mosche non pigmentate, effettuare ulteriori misurazioni delle corrispondenti aree del corpo cellulare. Misurare la fluorescenza di altri due ommatidi, ottenendo tre repliche tecniche.
Contrassegnare l'ommatidi analizzata utilizzando lo strumento Matita e salvare questa immagine per la documentazione. Selezionare e copiare i valori di grigio misurati dalla finestra dei risultati e incollarli nel software del foglio di calcolo per ulteriori calcoli. Ordina i valori di intensità della fluorescenza in base alla loro origine nelle categorie rhabdomere, corpo cellulare e sfondo e calcola l'intensità media di ciascuna categoria.
Quindi, calcolare la quantità relativa di eGFP presente nel rabdomere utilizzando la prima formula per gli occhi non pigmentati e la seconda per gli occhi pigmentati. In alternativa, per quantificare la morfologia dell'occhio mediante fluorescenza eGFP in micrografie ad immersione in acqua, scegliere tre ommatidi adiacenti in una regione rappresentativa dell'immagine a fuoco. Valutare i 18 rhabdomere della selezione individualmente in base alla loro intensità eGFP, nitidezza dei bordi e contrasto rispetto al segnale di sfondo circostante.
Infine, assegna un punteggio ai rabdomeri chiaramente visibili con un valore di due, ai rabdomeri visibili settimanali con un valore di uno e ai rabdomere assenti con un valore pari a zero per generare un indice di degenerazione. Nelle mosche transgeniche Drosophila che esprimono una proteina di fusione eGFP TRPL, la fluorescenza rabdomerale scompare alla luce a causa della traslocazione del TRPL eGFP. Ciò consente di eseguire uno screening genetico per identificare i mutanti difettosi nell'internalizzazione del TRPL eGFP.
Nelle mosche di controllo, eGFP TRPL trasloca dai rabdomeri nel corpo cellulare dopo 16 ore di illuminazione, con conseguente significativa diminuzione della fluorescenza rabdomerale rispetto allo stato adattato al buio. La seconda incubazione scura aumenta nuovamente la fluorescenza rabdomerale verso il valore iniziale. Tuttavia, nel mutante difettoso di traslocazione TRPL vps35MH20, il modello di fluorescenza non cambia drasticamente dopo 16 ore di illuminazione e un successivo adattamento al buio per 24 ore.
Questo metodo di quantificazione è in grado di rilevare un difetto di riciclaggio statisticamente molto significativo. Le mosche dagli occhi bianchi consentono il rilevamento di segnali di fluorescenza sia dal rabdomere che dal corpo cellulare. Al contrario, nelle mosche dagli occhi rossi, i segnali di fluorescenza sono rilevabili solo nei rabdomeri ma non nel corpo cellulare.
Per quanto riguarda la quantificazione della degenerazione retinica, la fluorescenza eGFP TRP può essere valutata nel corso di diverse settimane. Se tenuto in un ciclo di luce di 12 ore e buio di 12 ore per due settimane, l'indice di degenerazione è diminuito nelle mosche mutanti ma non nelle mosche di controllo. In questo protocollo, è necessario distinguere tra occhi pigmentati e non pigmentati.
Poiché la pigmentazione influisce sul segnale fluorescente, la microscopia quantitativa ad immersione in acqua è stata ottimizzata per entrambi i casi individualmente. L'imaging DPP e la microscopia ad immersione in acqua sono metodi ad alta produttività con risoluzione limitata. Per studiare la localizzazione subcellulare, raccomandiamo la microscopia a immunofluorescenza su sezioni di tessuto.
Per un'analisi dettagliata dei fenotipi degenerativi, è possibile eseguire la microscopia elettronica.
