GFPタグ付き光受容体タンパク質は、イオンチャネルTRPL GFPと同様に、非侵襲的技術を用いてニューロンにおけるタンパク質輸送を研究することを可能にする。この方法は、感光体の変性を監視するためにも使用することができる。したがって、ヒトの失明をもたらす遺伝性疾患の分子基盤をショウジョウバエの眼で研究することができる。
GFPタグ付きタンパク質の細胞局在は、深い偽瞳孔における蛍光を観察することによって、または水浸漬顕微鏡によって評価することができる。どちらの方法も、視覚タンパク質の局在を迅速に決定し、視細胞の変性によるラブドメアの構造欠陥を観察することを可能にする。高品質の画像を得るために、最も重要な側面はフライアイの向きです。
このテクニックを実行している間、人は目の末梢に向かってわずかに位置するオンマチジアに焦点を当てるべきです。DPPイメージングの手順を実演し、水浸漬顕微鏡を用いた2つの手法は、同僚のクリスティーナ・ワグナー博士と、私たちのグループの博士課程の学生であるマティアス・ゼーガーによって実証されます。深い偽瞳孔(DPP)のイメージングを開始するには、生後1〜3日のハエを麻酔し、左目または右目のいずれかが対物レンズに正確に放射状に向くように、顕微鏡対物レンズの中央にそれらの1つを横に置きます。
目全体にフィットするように倍率を上げ、目の中央のオンマチディアを中央に配置します。可能であれば、二重虹彩絞りを浅い設定に調整して、顕微鏡の被写界深度を下げます。次に、顕微鏡のUVランプを最大強度でオンにします。
そして、眼に発現する蛍光タンパク質に応じて顕微鏡の蛍光フィルターセットを選択し、顕微鏡搭載カメラに向かう光路を設定した。ソフトウェア内のライブイメージング機能を使用して、露光時間とゲイン値を上げて、目からの特定の信号のみを検出する設定に画像の明るさを調整します。顕微鏡の焦点を眼に再調整して、DPPの重畳画像を生成します。
次に、蛍光DPPのスナップショットを撮ります。致命的なバリエーションでフライを準備するには、プラスティシンの一部をオブジェクトのスライドに接着し、別の部分をペトリ皿の中心に接着します。氷冷した蒸留水といくつかの氷のフレークでペトリ皿を満たします。
次に、氷麻酔フライ1匹を実体顕微鏡下でプラスティックコーティングされた物体スライドの上に置きます。フライを背中に回し、胸郭の中心に昆虫のピンを突き刺します。プラスティシンでコーティングされたオブジェクト スライドにピンを水平に固定し、フライの左目または右目を上向きにします。
次に、プラスティックを含まない側をペトリ皿で下に向けてオブジェクトスライドを慎重に固定し、フライヘッドの回転を防ぎます。フライアイが水で覆われていることを確認してください。あるいは、致死的ではない変動でフライを準備するには、まず氷麻酔をかけたフライヘッドを200マイクロリットルのピペットチップに移し、圧縮空気でフライを先端に向かって慎重に押します。
次に、メスを使って頭のすぐ前のピペットチップを切り落とし、ピンセットを使ってフライを数ミリ丁寧にピペットチップに押し込みます。ピペットチップを再び切断し、フライの頭部のみがピペットチップから突出するように、圧縮空気でフライを先端に向かって押し戻します。プラスティシンをオブジェクトスライドに貼り付けた後、左目または右目が上を向くようにピペットチップを押し込みます。
顕微鏡下で目が正しい方向を向いていることを確認します。画像を取得するには、水没入対物レンズを選択します。致死的ではない変動の場合は、実験用ピペットを使用して、水浸漬目標の下側に大量の冷水を付着させます。
準備したフライでオブジェクトスライドを顕微鏡ステージに慎重に置きます。次に、水面に触れるか、フライの目が水滴に触れるまで、水浸漬対物レンズを手動で下げます。そして、顕微鏡カメラに向けて光路を切り替え、ライブ画像を生成する。
カメラの焦点を再調整し、目が顕微鏡の対物レンズを放射状に向かわなければならないことを考慮して、目の向きを評価します。ルックアップテーブルソフトウェアを使用して、過飽和を検出します。色素沈着していないハエの場合は、最も明るいピクセルがすべての画像の彩度制限のすぐ下になるように露光時間を調整します。
画像を記録し、それを生ファイルとして保存して、記録の対応するすべてのメタデータをアーカイブします。次に、画像を tif 形式でエクスポートします。水浸漬顕微鏡写真の横紋体における相対的なeGFP蛍光を定量化するには、[分析]、[測定値の設定]をクリックしてImageJ設定を調整し、[平均グレー値]のボックスのみをオンにします。
[ファイル]をクリックしてtifイメージをインポートし、[開く]をクリックします。ピントが合っている画像の代表的な領域を選択し、Ctrlキーを押しながら一緒に繰り返して200〜300%に拡大します。次に、楕円形ツールを選択し、Shift キーを押しながら、1 つの蛍光横紋筋よりも大幅に小さい円形の選択範囲を画像内に生成します。
次に、ImageJメインウィンドウのツールバーの下に表示される正確なサイズを探します。円形選択範囲内の蛍光強度を測定するには、キーボードの矢印キーで円を最初のラブドミアに移動し、「分析」をクリックしてから「測定」をクリックします。測定されたグレー値を一覧表示する結果ウィンドウがポップアップ表示されます。
ラブドメア2~6本の測定を続け、バックグラウンド信号も測定します。色素沈着していないハエの場合、対応する細胞体領域の追加測定を行う。さらに2つのオンマチジアの蛍光を測定し、3つの技術的反復をもたらす。
鉛筆ツールを使用して分析されたオンマチディアにマークを付け、この画像をドキュメント用に保存します。結果表示ウィンドウから測定されたグレー値を選択してコピーし、スプレッドシートソフトウェアに貼り付けてさらに計算します。蛍光強度値を起源に応じて横紋岩、細胞体、バックグラウンドのカテゴリにソートし、各カテゴリから平均強度を計算します。
次に、非色素沈着眼については第1の式、色素沈着眼については第2の式を用いてラブドミア中に存在するeGFPの相対量を計算する。あるいは、水浸漬顕微鏡写真におけるeGFP蛍光によって眼形態を定量化し、焦点が合っている画像の代表領域において隣接する3つのオンマチジアを選択する。選択範囲の18個のラブドメアを、周囲のバックグラウンド信号に対するeGFP強度、エッジシャープネス、およびコントラストに従って個別に評価します。
最後に、はっきりと見えるラブドメアを値2、週ごとに見えるラブドメアを1の値で、存在しないラブドメアをゼロの値でスコア付けして、変性指数を生成します。eGFP TRPL融合タンパク質を発現するトランスジェニックショウジョウバエにおいて、eGFP TRPLの転座により横紋体蛍光が光で消失する。これにより、eGFP TRPLのインターナリゼーションにおいて欠損した変異体を同定するための遺伝子スクリーニングを行うことができる。
対照ハエにおいて、eGFP TRPLは、16時間の照明後にラブドメアから細胞体内にトランスロケーションし、暗適応状態と比較してラブドメラ蛍光の有意な減少をもたらす。2回目の暗黒インキュベーションは、ラブドメラ蛍光を初期値に向かって再び上昇させる。しかしながら、TRPL転座欠損変異体vps35MH20では、蛍光パターンは、16時間の照明およびその後の24時間の暗順応後も劇的に変化しない。
この定量化方法により、統計的に有意性の高いリサイクル欠陥を検出することができる。白い目のハエは、ラブドミアと細胞体の両方からの蛍光シグナルの検出を可能にします。対照的に、赤い目のハエでは、蛍光シグナルはラブドメアでのみ検出可能であり、細胞体では検出できない。
網膜変性の定量化に関しては、eGFP TRP蛍光を数週間にわたって評価することができる。12時間の明暗サイクルで2週間保持すると、変性指数は変異ハエでは低下したが、対照ハエでは低下しなかった。このプロトコルでは、色素沈着した目と色素沈着していない目を区別する必要があります。
色素沈着は蛍光シグナルに影響を与えるため、定量的な水浸漬顕微鏡は両方のケースで個別に最適化されています。DPPイメージングと水浸漬顕微鏡は、解像度が限られている高スループットの方法です。細胞内局在を調べるには、組織切片の免疫蛍光顕微鏡検査をお勧めします。
変性表現型の詳細な分析のために、電子顕微鏡検査を行うことができる。
