GFP-markierte Photorezeptorproteine, wie der Ionenkanal TRPL GFP, ermöglichen es uns, den Proteintransport in Neuronen mit nichtinvasiven Techniken zu untersuchen. Diese Methode kann auch zur Überwachung der Photorezeptordegeneration verwendet werden. So können die molekularen Grundlagen von Erbkrankheiten, die beim Menschen zur Erblindung führen, im Drosophila-Auge untersucht werden.
Die zelluläre Lokalisation von GFP-markierten Proteinen kann durch Beobachtung der Fluoreszenz in der tiefen Pseudopupille oder durch Wasserimmersionsmikroskopie beurteilt werden. Beide Methoden ermöglichen eine schnelle Bestimmung der Lokalisation visueller Proteine und die Beobachtung struktureller Defekte von Rhabdomeren aufgrund der Degeneration von Photorezeptorzellen. Um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten, ist der wichtigste Aspekt die Ausrichtung des Fliegenauge.
Während der Durchführung dieser Technik sollte man sich auf Ommatidien konzentrieren, die sich leicht in Richtung der Peripherie des Auges befinden. Ich werde das Verfahren der DPP-Bildgebung demonstrieren, während die beiden Techniken mit Wasserimmersionsmikroskopie von meiner Kollegin Dr. Krystina Wagner und Matthias Zeger, einem Doktoranden in unserer Gruppe, demonstriert werden. Um mit der Tiefen-Pseudopupillen- oder DPP-Bildgebung zu beginnen, betäuben Sie ein bis drei Tage alte Fliegen und positionieren Sie eine von ihnen in der Mitte des Mikroskopobjektivs auf der Seite, so dass entweder das linke oder rechte Auge dem Objektiv genau radial zugewandt ist.
Erhöhen Sie die Vergrößerung, um das gesamte Auge anzupassen, und zentrieren Sie die zentralen Ommatidien des Auges. Wenn möglich, verringern Sie die Schärfentiefe des Mikroskops, indem Sie die Doppelblende der Blende auf eine flache Einstellung einstellen. Als nächstes schalten Sie die UV-Lampe des Mikroskops mit maximaler Intensität ein.
Wählen Sie dann den Fluoreszenzfiltersatz des Mikroskops entsprechend dem in den Augen exprimierten Fluoreszenzprotein aus und stellen Sie den Lichtweg in Richtung der am Mikroskop montierten Kamera ein. Passen Sie die Bildhelligkeit mithilfe der Live-Imaging-Funktion in der Software an eine Einstellung an, die nur bestimmte Signale des Auges erkennt, indem Sie die Belichtungszeit und den Verstärkungswert erhöhen. Richten Sie den Mikroskopfokus in das Auge ein, um das überlagerte Bild des DPP zu erzeugen.
Machen Sie dann einen Schnappschuss des fluoreszierenden DPP. Um eine Fliege in einer tödlichen Variante vorzubereiten, kleben Sie ein Stück Plastilin auf einen Objektträger und ein weiteres Stück in die Mitte einer Petrischale. Füllen Sie die Petrischale mit eisgekühltem destilliertem Wasser und einigen Eisflocken.
Legen Sie dann eine eisbetäubte Fliege unter ein Stereomikroskop auf den mit Plastilin beschichteten Objektträger. Drehen Sie die Fliege auf den Rücken und durchbohren Sie eine Insektennadel durch die Mitte des Brustkorbs. Befestigen Sie den Stift horizontal auf dem mit Plastilin beschichteten Objektträger und richten Sie entweder das linke oder das rechte Auge der Fliege nach oben.
Fixieren Sie dann vorsichtig den Objektträger mit seiner Plastilin-freien Seite nach unten in der Petrischale, um eine Rotation des Fliegenkopfes zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass das Fliegenauge mit Wasser bedeckt ist. Alternativ, um eine Fliege in einer nicht-tödlichen Variante vorzubereiten, übertragen Sie die eisbetäubte Fliege mit dem Kopf zuerst in eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze und drücken Sie die Fliege vorsichtig mit Druckluft in Richtung der Spitze.
Schneiden Sie dann mit einem Skalpell die Pipettenspitze direkt vor dem Kopf ab und drücken Sie die Fliege vorsichtig einige Millimeter in die Pipettenspitze. Schneiden Sie die Pipettenspitze wieder ab und drücken Sie die Fliege mit der Druckluft zurück zur Spitze, so dass nur der Kopf der Fliege aus der Pipettenspitze herausragt. Nachdem Sie ein Stück Plastilin auf einen Objektträger geklebt haben, drücken Sie die Pipettenspitze so hinein, dass das linke oder rechte Auge nach oben zeigt.
Stellen Sie sicher, dass das Auge unter dem Mikroskop richtig ausgerichtet ist. Wählen Sie für die Bildaufnahme ein Objektiv zum Eintauchen in Wasser aus. Im Falle einer nicht-tödlichen Variation verwenden Sie eine Laborpipette, um einen großen Tropfen gekühlten Wassers an der Unterseite des Wassertauchobjektivs zu haften.
Legen Sie den Objektträger mit der vorbereiteten Fliege vorsichtig auf den Mikroskoptisch. Senken Sie dann das Wassertauchobjektiv manuell ab, bis es die Wasseroberfläche berührt oder das Auge der Fliege den Tropfen berührt. Schalten Sie dann den Lichtweg in Richtung der Mikroskopkamera um und erzeugen Sie ein Livebild.
Stellen Sie den Fokus für die Kamera neu und bewerten Sie die Ausrichtung des Auges, wobei zu berücksichtigen ist, dass das Auge dem Mikroskopobjektiv radial zugewandt sein muss. Verwenden Sie die Nachschlagetabellensoftware, um Übersättigung zu erkennen. Bei nicht pigmentierten Fliegen sollten Sie die Belichtungszeit so einstellen, dass die hellsten Pixel für jedes Bild knapp unter der Sättigungsgrenze liegen.
Nehmen Sie ein Bild auf und speichern Sie es als Rohdatei, um alle entsprechenden Metadaten der Aufnahme zu archivieren. Exportieren Sie dann das Bild in ein tif-Format. Um die relative eGFP-Fluoreszenz in den Rhabdomeren von Wassertauchmikroskopen zu quantifizieren, passen Sie die ImageJ-Einstellungen an, indem Sie auf Analysieren klicken, dann auf Messungen einstellen klicken und nur das Kontrollkästchen für den mittleren Grauwert aktivieren.
Importieren Sie das tif-Bild, indem Sie auf Datei und dann auf Öffnen klicken. Wählen Sie einen repräsentativen Bereich des fokussierten Bildes und vergrößern Sie ihn auf 200 bis 300 %, indem Sie wiederholt die Strg-Taste drücken und zusammen. Wählen Sie als Nächstes das Oval-Werkzeug aus und erzeugen Sie beim Drücken der Umschalttaste eine kreisförmige Auswahl im Bild, die deutlich kleiner als eine fluoreszierende Rhabdomere ist.
Suchen Sie dann nach der genauen Größe, die unter der Symbolleiste im ImageJ-Hauptfenster angezeigt wird. Um die Fluoreszenzintensitäten innerhalb der kreisförmigen Auswahl zu messen, bewegen Sie den Kreis mit den Pfeiltasten auf der Tastatur zum ersten Rhabdomere, und klicken Sie auf Analysieren und dann auf Messen. Ein Ergebnisfenster mit dem gemessenen Grauwert wird angezeigt.
Fahren Sie mit Messungen von Rhabdomeren zwei bis sechs fort und messen Sie auch das Hintergrundsignal. Nehmen Sie bei nicht pigmentierten Fliegen zusätzliche Messungen der entsprechenden Zellkörperbereiche vor. Messen Sie die Fluoreszenz von zwei weiteren Ommatidien, was zu drei technischen Replikaten führt.
Markieren Sie die analysierten Ommatidien mit dem Bleistiftwerkzeug und speichern Sie dieses Bild zur Dokumentation. Wählen Sie die gemessenen Grauwerte aus, kopieren Sie sie aus dem Ergebnisfenster und fügen Sie sie zur weiteren Berechnung in die Tabellenkalkulationssoftware ein. Sortieren Sie die Fluoreszenzintensitätswerte nach ihrer Herkunft in die Kategorien Rhabdomere, Zellkörper und Hintergrund und berechnen Sie die mittlere Intensität aus jeder Kategorie.
Berechnen Sie dann die relative Menge an eGFP, die im Rhabdomere vorhanden ist, indem Sie die erste Formel für nicht pigmentierte Augen und die zweite für pigmentierte Augen verwenden. Alternativ können Sie zur Quantifizierung der Augenmorphologie durch eGFP-Fluoreszenz in Wasser-Tauchmikroskopie-Aufnahmen drei benachbarte Ommatidien in einem repräsentativen Bereich des Bildes auswählen, der im Fokus steht. Bewerten Sie die 18 Rhabdomere der Auswahl individuell nach ihrer eGFP-Intensität, Kantenschärfe und Kontrast in Bezug auf das umgebende Hintergrundsignal.
Bewerten Sie schließlich die deutlich sichtbaren Rhabdomeres mit einem Wert von zwei, wöchentlich sichtbare Rhabdomeres mit einem Wert von eins und fehlende Rhabdomeres mit einem Wert von Null, um einen Degenerationsindex zu erzeugen. In transgenen Drosophila-Fliegen, die ein eGFP TRPL-Fusionsprotein exprimieren, verschwindet die rhabdomerale Fluoreszenz aufgrund der Translokation des eGFP TRPL im Licht. Dies ermöglicht die Durchführung eines genetischen Screenings, um Mutanten zu identifizieren, die bei der Internalisierung des eGFP TRPL defekt sind.
Bei Kontrollfliegen transloziert eGFP TRPL nach 16 Stunden Beleuchtung aus den Rhabdomeren in den Zellkörper, was zu einer signifikanten Abnahme der rhabdomeralen Fluoreszenz im Vergleich zum dunkel angepassten Zustand führt. Die zweite dunkle Inkubation hebt die rhabdomerale Fluoreszenz wieder auf den Ausgangswert an. Bei der TRPL-Translokationsdefekten Mutante vps35MH20 ändert sich das Fluoreszenzmuster jedoch nach 16 Stunden Beleuchtung und einer anschließenden Dunkelanpassung für 24 Stunden nicht drastisch.
Diese Quantifizierungsmethode kann einen statistisch hochsignifikanten Recyclingfehler nachweisen. Weißäugige Fliegen ermöglichen den Nachweis von Fluoreszenzsignalen sowohl aus dem Rhabdomere als auch aus dem Zellkörper. Im Gegensatz dazu sind bei rotäugigen Fliegen Fluoreszenzsignale nur in Rhabdomeren nachweisbar, nicht aber im Zellkörper.
Hinsichtlich der Quantifizierung der Netzhautdegeneration kann die eGFP TRP-Fluoreszenz über mehrere Wochen beurteilt werden. Wenn der Degenerationsindex zwei Wochen lang in einem 12-stündigen hellen, 12-stündigen Dunkelzyklus gehalten wurde, sank er bei mutierten Fliegen, aber nicht bei Kontrollfliegen. In diesem Protokoll muss man zwischen pigmentierten und nicht pigmentierten Augen unterscheiden.
Da die Pigmentierung das Fluoreszenzsignal beeinflusst, wurde die quantitative Wasserimmersionsmikroskopie für beide Fälle einzeln optimiert. DPP-Bildgebung und Wasserimmersionsmikroskopie sind Hochdurchsatzmethoden mit begrenzter Auflösung. Um die subzelluläre Lokalisation zu untersuchen, empfehlen wir die Immunfluoreszenzmikroskopie an Gewebeschnitten.
Für eine detaillierte Analyse degenerativer Phänotypen kann eine Elektronenmikroskopie durchgeführt werden.
