GFP etiketli fotoreseptör proteinleri, iyon kanalı TRPL GFP gibi, invaziv olmayan teknikler kullanarak nöronlardaki protein taşınımını incelememize izin verir. Bu yöntem fotoreseptör dejenerasyonunu izlemek için de kullanılabilir. Böylece, insanlarda körlükle sonuçlanan kalıtsal hastalıkların moleküler temeli Drosophila gözünde incelenebilir.
GFP etiketli proteinlerin hücresel lokalizasyonu, derin psödopupildeki floresan gözlenerek veya suya daldırma mikroskobu ile değerlendirilebilir. Her iki yöntem de görsel proteinlerin lokalizasyonunun hızlı bir şekilde belirlenmesine ve fotoreseptör hücrelerin dejenerasyonuna bağlı olarak rabdomerlerin yapısal kusurlarının gözlemlenmesine izin verir. Yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için en önemli husus sinek gözünün oryantasyonudur.
Bu tekniği uygularken, gözün çevresine doğru hafifçe yerleştirilmiş ommatidiye odaklanılmalıdır. DPP görüntüleme prosedürünü göstereceğim, su daldırma mikroskobu kullanan iki teknik meslektaşım Dr. Krystina Wagner ve grubumuzdaki doktora öğrencisi Matthias Zeger tarafından gösterilecek. Derin psödopupille veya DPP'ye başlamak için, görüntüleme, bir ila üç günlük sinekleri uyuşturun ve bunlardan birini mikroskop hedefinin ortasına yan tarafına yerleştirin, böylece sol veya sağ göz hedefe tam olarak radyal olarak bakar.
Tüm göze uyacak şekilde büyütmeyi artırın ve gözün merkezi ommatidisini ortalayın. Mümkünse, çift iris diyaframını sığ bir ayara ayarlayarak mikroskopun alan derinliğini azaltın. Ardından, mikroskop UV lambasını maksimum yoğunlukta açın.
Ardından, mikroskopun floresan filtre setini gözlerde ifade edilen floresan proteinine göre seçin ve mikroskopa monte edilmiş kameraya doğru ışık yolunu ayarlayın. Yazılımdaki canlı görüntüleme özelliğini kullanarak, görüntü parlaklığını, pozlama süresini artırarak ve değer kazanarak gözden yalnızca belirli sinyalleri algılayan bir ayara ayarlayın. DPP'nin üst üste binmiş görüntüsünü oluşturmak için mikroskop odağını göze yeniden ayarlayın.
Ardından, floresan DPP'nin anlık görüntüsünü alın. Ölümcül bir varyasyonda bir sinek hazırlamak için, bir parça Plasticine'i bir nesne slaytına ve başka bir parçayı bir Petri kabının ortasına yapıştırın. Petri kabını buzla soğutulmuş damıtılmış su ve biraz buz gevreği ile doldurun.
Ardından, Plasticine kaplı nesne slaytının üzerine stereo mikroskop altında bir buz anestezili sinek koyun. Sineği sırtına çevirin ve göğüs kafesinin ortasından bir böcek iğnesini delin. Pimi Hamuru kaplı nesne slaydına yatay olarak sabitleyin ve sineğin sol veya sağ gözünü yukarı doğru yönlendirin.
Ardından, nesne kızağını Petri kabında Plasticine içermeyen tarafı aşağı bakacak şekilde dikkatlice sabitleyin ve sinek kafasının dönmesini önleyin. Sinek gözünün suyla kaplı olduğundan emin olun. Alternatif olarak, ölümcül olmayan bir varyasyonda bir sinek hazırlamak için, buz anestezisi yapılan sinek kafasını önce 200 mikrolitrelik bir pipet ucuna aktarın ve sineği basınçlı hava ile uca doğru dikkatlice itin.
Daha sonra, bir neşter kullanarak, pipet ucunu başın hemen önünde kesin ve cımbız kullanarak sineği pipet ucuna birkaç milimetre dikkatlice itin. Pipet ucunu tekrar kesin ve sineği basınçlı hava ile uca doğru geri itin, böylece sineğin başı pipet ucundan sadece baş çıkıntı yapar. Bir parça Plasticine'i bir nesne slaytına yapıştırdıktan sonra, pipet ucunu sol veya sağ göz yukarı bakacak şekilde içine bastırın.
Gözün mikroskop altında doğru yönlendirildiğinden emin olun. Görüntü alma için, suya daldırma hedefi seçin. Ölümcül olmayan bir varyasyon durumunda, suya daldırma hedefinin alt tarafına büyük bir damla soğutulmuş su yapıştırmak için bir laboratuvar pipeti kullanın.
Nesne slaytını hazırlanan sinekle mikroskop aşamasına dikkatlice yerleştirin. Ardından, suya daldırma hedefini su yüzeyine temas edene veya sineğin gözü damlaya dokunana kadar manuel olarak indirin. Ardından, ışık yolunu mikroskop kamerasına doğru değiştirin ve canlı bir görüntü oluşturun.
Kamera için odağı yeniden ayarlayın ve gözün mikroskop hedefine radyal olarak bakması gerektiğini düşünerek gözün yönünü değerlendirin. Aşırı doygunluğu algılamak için arama tablosu yazılımını kullanın. Pigmentli olmayan sinekler söz konusu olduğunda, pozlama süresini, en parlak pikseller her görüntü için doygunluk sınırının hemen altında olacak şekilde ayarlayın.
Bir görüntü kaydedin ve kaydın ilgili tüm meta verilerini arşivlemek için ham dosya olarak kaydedin. Ardından, görüntüyü tif biçiminde dışa aktarın. Suya daldırma mikrograflarının rabdomerlerindeki göreceli eGFP floresansını ölçmek için, Analiz Et'e tıklayarak ImageJ ayarlarını yapın, ardından Ölçümleri Ayarla'ya tıklayın ve yalnızca Ortalama gri değer kutusunu işaretleyin.
tif görüntüsünü Dosya'ya ve ardından Aç'a tıklayarak içe aktarın. Odaktaki görüntünün temsili bir bölgesini seçin ve Kontrol tuşuna art arda basıp birlikte basarak görüntüyü %200 ila %300 arasında büyütün. Ardından, Oval aracı seçin ve Shift tuşuna basarken görüntüde bir floresan rabdomerden önemli ölçüde daha küçük olan dairesel bir seçim oluşturun.
Ardından, ImageJ ana penceresindeki araç çubuğunun altında görüntülenen tam boyutu arayın. Dairesel seçimdeki floresan yoğunluklarını ölçmek için, klavyedeki ok tuşlarıyla daireyi ilk rabdomere taşıyın ve Analiz Et'i, ardından Ölç'ü tıklayın. Ölçülen gri değeri listeleyen bir sonuç penceresi açılır.
İki ila altı rabdomer ölçümlerine devam edin ve ayrıca arka plan sinyalini ölçün. Pigmentli olmayan sinekler durumunda, ilgili hücre vücut alanlarının ek ölçümlerini yapın. İki ommatidianın daha floresansını ölçün, bu da üç teknik kopya ile sonuçlanır.
Kurşun Kalem aracını kullanarak analiz edilen ommatidiayı işaretleyin ve bu görüntüyü belgeler için kaydedin. Sonuç penceresinden ölçülen gri değerleri seçip kopyalayın ve daha fazla hesaplama için bunları elektronik tablo yazılımına yapıştırın. Floresan yoğunluk değerlerini kökenlerine göre rabdomere, hücre gövdesi ve arka plan kategorilerine göre sıralayın ve her kategoriden ortalama yoğunluğu hesaplayın.
Daha sonra, pigmentli olmayan gözler için ilk formülü ve pigmentli gözler için ikincisini kullanarak rabdomerede bulunan göreceli eGFP miktarını hesaplayın. Alternatif olarak, suya daldırma mikrograflarında eGFP floresansı ile göz morfolojisini ölçmek için, odakta olan görüntünün temsili bir bölgesinde üç bitişik ommatidia seçin. Seçimin 18 rabdomerini eGFP yoğunluğuna, kenar keskinliğine ve çevresindeki arka plan sinyaline göre kontrastına göre ayrı ayrı değerlendirin.
Son olarak, açıkça görülebilen rabdomerleri iki değerle, haftalık görünür rabdomerleri bir değerle ve eksik rabdomerleri sıfır değeriyle bir dejenerasyon indeksi oluşturmak için puanlayın. Bir eGFP TRPL füzyon proteinini eksprese eden transgenik Drosophila sineklerinde, rabdomeral floresan, eGFP TRPL'nin translokasyonu nedeniyle ışıkta kaybolur. Bu, eGFP TRPL'nin içselleştirilmesinde kusurlu mutantları tanımlamak için genetik bir tarama yapılmasına izin verir.
Kontrol sineklerinde, eGFP TRPL, 16 saatlik aydınlatmadan sonra rabdomerlerden hücre gövdesine geçer ve bu da karanlığa adapte olmuş duruma kıyasla rabdomeral floresansta önemli bir azalmaya neden olur. İkinci karanlık inkübasyon, rabdomeral floresanı tekrar başlangıç değerine doğru yükseltir. Bununla birlikte, TRPL translokasyon kusurlu mutant vps35MH20'de, floresan paterni 16 saatlik aydınlatmadan ve ardından 24 saat boyunca karanlık bir adaptasyondan sonra büyük ölçüde değişmez.
Bu niceleme yöntemi, istatistiksel olarak oldukça anlamlı bir geri dönüşüm kusurunu tespit edebilir. Beyaz gözlü sinekler, hem rabdomere hem de hücre gövdesinden gelen floresan sinyallerinin algılanmasını sağlar. Buna karşılık, kırmızı gözlü sineklerde, floresan sinyalleri sadece rabdomerlerde tespit edilebilir, ancak hücre gövdesinde tespit edilemez.
Retina dejenerasyonunun miktarıyla ilgili olarak, eGFP TRP floresansı birkaç hafta boyunca değerlendirilebilir. İki hafta boyunca 12 saatlik bir ışıkta, 12 saatlik karanlık döngüde tutulduğunda, dejenerasyon indeksi mutant sineklerde azaldı, ancak kontrol sineklerinde azalmadı. Bu protokolde, pigmentli ve pigmentsiz gözler arasında ayrım yapmak gerekir.
Pigmentasyon floresan sinyalini etkilediğinden, kantitatif su daldırma mikroskobu her iki durum için ayrı ayrı optimize edilmiştir. DPP görüntüleme ve suya batırma mikroskobu, sınırlı çözünürlüğe sahip yüksek verimli yöntemlerdir. Subsellüler lokalizasyonu araştırmak için, doku kesitlerinde immünofloresan mikroskopiyi öneriyoruz.
Dejeneratif fenotiplerin ayrıntılı bir analizi için elektron mikroskobu yapılabilir.
