Se ha establecido la espectroscopia de resonancia de plasmones de superficie para la determinación del ligando proteico de forma de rendimiento medio. Se presentan diferentes afinidades para las variantes del sitio de unión de la misma molécula, a saber, para los oligosacáridos de alta unión al hierro en los virus. SPR es una técnica sin etiquetas para estudiar la unión macromolecular en tiempo real de receptores inmovilizados superficiales.
Las interacciones multisitio se reconocen en el análisis cinético mediante la unión competitiva independientemente del tamaño de las áreas específicas en la investigación que utilizan SPR son el desarrollo de fármacos para buscar inhibidores o caracterización de anticuerpos. Las constantes cinéticas y las afinidades se calculan directamente a partir de la respuesta del sensor. Para comenzar, transfiera 100 microlitros de la solución en placas de agar LB y extiéndala suavemente usando un esparcidor de células estériles.
Comience una serie de reacciones de muestra utilizando múltiples concentraciones de plantilla de ADN bicatenario que van de cinco a 50 nanogramos mientras mantiene constante la concentración del cebador. Luego agregue la enzima de restricción DpnI debajo de la capa de aceite mineral e incube inmediatamente a 37 grados centígrados durante una hora para digerir el ADN bicatenario superenrollado parental. Para descongelar las células supercompetentes XL1-Blue, alícuota las células a un tubo inferior redondo, pequeño y preenfriado.
A continuación, transfiera un microlitro de ADN monocatenario tratado con DpnI de cada reacción de control y muestra a alícuotas separadas de las células supercompetentes que sintetizan la cadena complementaria. Después de agitar las reacciones de transformación cuidadosamente para mezclar, incubar las reacciones en hielo durante 30 minutos. Aplique pulso de calor a las reacciones de transformación a 42 grados centígrados durante 45 segundos y luego coloque las reacciones en hielo durante dos minutos.
Luego agregue 0.5 mililitros de NZY + Caldo e incube las reacciones de transformación a 37 grados Celsius con agitación a 225 a 250 RPM durante una hora. Después, coloque el volumen correcto de cada reacción de transformación en placas de agar ampicilina LB como se demostró anteriormente. Para un cultivo de semillas, inocular una pequeña cantidad de ampicilina que contenga medios LB con una sola colonia de la placa transformada.
Usando el cultivo durante la noche, inocular el cultivo de expresión con aditivos que incluyen 10 milimolares de cloruro de magnesio, 10 milimolares de sulfato de magnesio y 20 milimolares de glucosa, diluyendo el cultivo de semillas a uno por 100. A continuación, cultive células con agitación vigorosa a 37 grados centígrados a un absorbente de 600 nanómetros entre 0,4 y 0,6 antes de enfriar las células a 20 grados centígrados e inducir con un IPTG milimolar y crecer durante la noche. Luego cosecha las células centrifugando a 4, 000 g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados y desecha el sobrenadante.
Después de resuspender el pellet celular en tampón salino tamponado con fosfato, refugio reciente a 4, 000 g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, deseche el sobrenadante con una pipeta. A continuación, vuelva a suspender el pellet restante en 10 mililitros de tampón de lisis e incube la suspensión durante una hora a 37 grados centígrados.
Luego separe las fracciones solubles e insolubles por centrifugación a 4, 000 g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Además, utilice HIS-Select Ni2+Affinity Gel en tubos de 14 mililitros para unir y resuspender su cianovirina-N recombinantemente expresada en soluciones tampón con 20 milimolares de imidazol y 250 milimolares de imidazol, respectivamente. Incubar en lote durante al menos 30 minutos entre estos pasos.
Agregar el tampón de elución que contiene 250 milimolares de imidazol a la proteína de eluy. Transfiera las soluciones proteicas a tubos de centrifugación con un filtro de corte Dalton de 10 kilos y concéntrelos centrifugando durante 10 minutos a 4, 500 g y cuatro grados centígrados. Agregue el tampón de funcionamiento SPR a un factor de dilución de uno a 10 y centrifugar cuatro veces hasta el volumen inicial durante 10 minutos a 4, 500 g y cuatro grados centígrados.
Después, determine la concentración de proteína a 280 nanómetros utilizando un espectrofotómetro NanoDrop UV-Visible basado en el coeficiente de extinción calculado para la proteína principal CVN2L0 que muestra un tamaño de 23, 474 Dalton. Para el sistema SPR de doble canal, use HBSCP plus como tampón de funcionamiento, ácido clorhídrico de glicina milimolar de pH 1.5 a 1.6 como tampón de regeneración y encienda el desgasificador del instrumento, el muestreador automático y la bomba. Luego lave todo el sistema con agua destilada doble durante una hora.
A continuación, deje caer el aceite de inmersión en el detector y monte un chip sensor de vidrio recubierto con una fina película de oro. Y en la parte superior, funcionalizado con hidrogel de carboximetil dextrano directamente sobre el detector debajo de la celda de flujo de tres puertos. A continuación, fije la configuración tirando hacia abajo del manejo.
Para inmovilizar los ligandos proteicos a los chips sensores, abra una tabla de ejecución haciendo clic en Formulario en la barra de menú y ejecute el editor de tablas en el software de enlace automático SPP integrado. Luego elija y haga clic en Inmovilización básica de la lista de tablas de ejecución disponibles y siga los pasos del procedimiento experimental en la pantalla de la computadora. A continuación, haga clic en Sample Set Editor en la sección de formularios para completar la lista de reactivos para dos bastidores colocados en el muestreador automático para su posterior análisis.
Haga clic en Autosampler Direct Control como herramienta en la barra de menú para llevar los bastidores hacia adelante o de vuelta a casa y elija cuatro grados centígrados como temperatura de funcionamiento. Encienda la bomba para infundir agua destilada doble haciendo clic en las herramientas y el control directo de la bomba. Y registre datos haciendo clic en SPR Instrument Direct Control.
Y cada vez, comience en la ventana que aparece de nuevo. Después de agregar los reactivos de acoplamiento en viales de 300 microlitros, colóquelos en los bastidores de muestreador automático e inicie la tabla de ejecución haciendo clic en Ejecutar. Para la interacción simple proteína-proteína, después de rellenar la bomba a 25, 000 microlitros por minuto, realice el ajuste de línea de base durante 30 segundos.
Permita el ajuste de referencia posterior con agua destilada doble durante 1,5 minutos antes de enfriar la superficie del chip activado con un clorhidrato molar de etanolamina, pH 8,5. A continuación, cambie los tubos del muestreador de líquido al desgasificador de agua destilada doble en la botella con HBS-EP + Haga clic en Formulario, desplácese hacia abajo y cambie a Post-Procesamiento haciendo clic en este modo de operación. Luego haga clic en Agregar para seleccionar las curvas de enlace generadas a lo largo del tiempo en la plataforma de datos para cada celda de flujo y exportar la superposición como un archivo depurador.
A continuación, haga clic en Archivo para abrir las opciones de guardado del archivo y obtener curvas de respuesta alineando las curvas izquierda y derecha y restando las señales del segundo canal de referencia de las del canal de ligando. Las inyecciones individuales de CVN2L0 y varianza V2 y V5 se probaron primero para la unión al chip sensor acoplado a hemaglutinina para estimar las capacidades de unión utilizando el muestreador automático y el editor de tablas en ejecución. Las inyecciones repetidas se automatizaron a varias concentraciones en el rango nanomolar y micromolar en el sistema a lo largo del tiempo, lo que demuestra que no se logró ninguna saturación en la superficie del chip ni unión al equilibrio.
La concentración versus respuesta se trazó para la unión de tipo salvaje CVN a RBD, asumiendo una orientación específica de carbohidratos posiblemente conservados en la subunidad RBD S1 con una afinidad más débil que tiene una constante de tasa de disociación de 260 micromoles. La misma gráfica de afinidad para la unión CVN2L0-V4 a DM ya no es analizable debido a la sustitución de enlaces disulfuro que interfieren con la unión de alta afinidad a péptidos glicosilados pequeños y produce una respuesta mayor que el valor máximo de respuesta. La unión de tipo salvaje CVN a RBD en SARS-CoV-2 muestra unión a la proteína S y RBD con una constante de rabia de disociación de 18.6 micromoles y 260 micromoles, respectivamente.
Aunque la respuesta SPR para las concentraciones de analito da como resultado unidades de alta respuesta y sensorgramas SPR típicos para CVN de tipo salvaje y unión E41A. Sin embargo, el mutante es inestable cuando se diluye. La biodetección SPR está abordando la unión de alta afinidad y baja afinidad de proteínas purificadas y sus variantes a ligandos.
En nuestro caso, las glicoproteínas que explotan la lectura óptica y el sistema de flujo de doble canal en la superficie del chip sensor. El ensayo de enzimas inmunoabsorbentes es un método inmunológico alternativo que reconoce epítopos de proteínas, pero también proporciona datos sobre la concentración de péptidos y moléculas pequeñas a partir de matrices complejas. Las pruebas de proteínas expresadas recombinantemente mediante ensayos de unión SPR incorporaron biodetección de cambios confirmacionales que son útiles para la verificación y predicción de la estabilidad de proteínas por el lado computacional de la proteína.
