Установлена поверхностно-плазмонная резонансная спектроскопия для определения белкового лиганда способом средней пропускной способности. Представлены различные сродства к вариантам сайта связывания одной и той же молекулы, а именно к железосвязывающим высоким манерам олигосахаридов на вирусах. SPR - это метод без меток для изучения макромолекулярного связывания поверхностных иммобилизованных рецепторов в режиме реального времени.
Мультисайтовые взаимодействия распознаются в кинетическом анализе путем конкурентного связывания независимо от размера специфических областей в исследованиях, в которых используются SPR для разработки лекарств для поиска ингибиторов или характеристик антител. Кинетические константы и сродства вычисляются непосредственно по отклику датчика. Для начала переложите 100 микролитров раствора на пластины LB-агара и аккуратно распределите его с помощью стерильного клеточного распределителя.
Начните серию реакций с образцами, используя несколько концентраций двухцепочечного шаблона ДНК в диапазоне от пяти до 50 нанограммов, сохраняя при этом постоянную концентрацию праймера. Затем добавьте фермент рестрикции DpnI ниже наложения минерального масла и сразу же инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение одного часа для переваривания родительской суперспиральной двухцепочечной ДНК. Чтобы разморозить XL1-Blue Supercompetent Cells, аликвотируйте клетки в предварительно охлажденную, маленькую, круглую нижнюю трубку.
Затем перенесите один микролитр обработанной DpnI одноцепочечной ДНК из каждой контрольной и пробной реакции в отдельные аликвоты суперкомпетентных клеток, которые синтезируют комплементарную цепь. После закручивания реакций трансформации тщательно перемешать, инкубировать реакции на льду в течение 30 минут. Примените тепловой импульс к реакциям превращения при 42 градусах Цельсия в течение 45 секунд, а затем поместите реакции на лед на две минуты.
Затем добавляют 0,5 миллилитра NZY+Broth и инкубируют реакции трансформации при 37 градусах Цельсия с встряхиванием при 225-250 об/мин в течение одного часа. После этого наносится правильный объем каждой реакции трансформации на пластинах LB Ampicillin Agar, как показано ранее. Для посевной культуры привить небольшое количество ампициллина, содержащего LB-среду, одной колонией из преобразованной пластины.
Используя культуру на ночь, инокулируют экспрессионную культуру добавками, включающими 10 миллимоляров хлорида магния, 10 миллимоляров сульфата магния и 20 миллимоляров глюкозы, разбавляя посев семян до одного на 100. Затем вырастите клетки с энергичным встряхиванием при 37 градусах Цельсия до абсорбента 600 нанометров от 0,4 до 0,6 до охлаждения клеток до 20 градусов Цельсия и индуцируйте с помощью одного миллимоляра IPTG и расти в течение ночи. Затем собирают клетки путем центрифугирования при 4000 г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия и выбрасывают супернатант.
После повторного использования клеточной гранулы в фосфатно-буферном солевом буфере, недавнее укрытие в 4000 г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Затем выбросьте супернатант пипеткой. Далее повторно суспендируют оставшуюся гранулу в 10 миллилитрах лизисного буфера и инкубируют суспензию в течение одного часа при 37 градусах Цельсия.
Затем разделяют растворимые и нерастворимые фракции методом центрифугирования по 4 000 г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Кроме того, используйте HIS-Select Ni2+Affinity Gel в 14 миллилитрах для связывания и повторного суспендирования его меченого рекомбинантно экспрессированного циановирина-N в буферных растворах с 20 миллимолярным имидазолом и 250 миллимолярным имидазолом соответственно. Инкубируйте в партии в течение не менее 30 минут между этими этапами.
Добавление буфера элюирования, содержащего 250 миллимоляров имидазола, к белку элюции. Переложите белковые растворы в центрифугирующие трубки с помощью отсечного фильтра Дальтона весом 10 кг и концентрируйте их путем центрифугирования в течение 10 минут при 4, 500 г и четырех градусах Цельсия. Добавьте рабочий буфер SPR к коэффициенту разбавления от одного до 10 и центрифугу четыре раза к исходному объему в течение 10 минут при 4 500 г и четырех градусах Цельсия.
После этого определите концентрацию белка на 280 нанометрах с помощью УФ-видимого спектрофотометра NanoDrop на основе расчетного коэффициента вымирания для основного белка CVN2L0, показывающего размер 23 474 Дальтона. Для двухканальной системы SPR используйте HBSCP plus в качестве рабочего буфера, 10-миллимолярную глициновую соляную кислоту pH от 1,5 до 1,6 в качестве буфера регенерации и включите дегазатор прибора, автосамплер и насос. Затем промыть всю систему двойной дистиллированной водой в течение одного часа.
Затем капните погружное масло на детектор и установите стеклянный чип датчика, покрытый тонкой золотой пленкой. А на верхней стороне функционализированный карбоксиметилдекстран гидрогелем непосредственно на детекторе под трехпортовой проточной ячейкой. Затем исправьте настройку, потянув вниз обработку.
Чтобы обездвижить белковые лиганды в сенсорные чипы, откройте таблицу выполнения, нажав на Форму в строке меню, и запустите редактор таблиц в интегрированном программном обеспечении SPP auto link. Затем выберите и нажмите «Базовая иммобилизация» из списка доступных таблиц запуска и следуйте шагам экспериментальной процедуры на экране компьютера. Затем нажмите на Sample Set Editor в разделе формы, чтобы заполнить список реагентов для двух стоек, размещенных в автосамплере для дальнейшего анализа.
Нажмите на Autosampler Direct Control в качестве инструмента в строке меню, чтобы переместить стойки вперед или домой и выбрать четыре градуса Цельсия в качестве рабочей температуры. Запустите насос для вливания двойной дистиллированной воды, щелкнув по инструментам и прямому управлению насосом. И записывайте данные, нажав на SPR Instrument Direct Control.
И каждый раз начинайте с вновь открывающегося окна. После добавления реагентов связи в 300 микролитровых флаконах поместите их в стойки автопробоотборника и запустите таблицу запуска, нажав кнопку Выполнить. Для простого белково-белкового взаимодействия после заправки насоса со скоростью 25 000 микролитров в минуту выполните базовую настройку в течение 30 секунд.
Обеспечьте последующую корректировку исходного уровня двойной дистиллированной водой в течение 1,5 минут перед закалкой активированной поверхности чипа одним молярным этаноламина гидрохлоридом, рН 8,5. Затем переключите трубки с пробоотборника жидкости на дегазатор из двойной дистиллированной воды в бутылку с помощью HBS-EP + Нажмите на форму, прокрутите вниз и перейдите на Постобработка, щелкнув этот режим работы. Затем нажмите кнопку Добавить, чтобы выбрать кривые привязки, сгенерированные с течением времени в платформе данных для каждой проточной ячейки, и экспортировать наложение в виде файла скруббера.
Затем нажмите «Файл», чтобы открыть параметры сохранения файла и получить кривые отклика, выровняв левую и правую кривые и вычитая сигналы второго опорного канала из сигналов лигандного канала. Одиночные инъекции CVN2L0 и дисперсии V2 и V5 были впервые протестированы на связывание с чипом датчика, связанным с гемагглютинином, для оценки емкости связывания с использованием автосэмплера и редактора работающих таблиц. Повторные инъекции были автоматизированы при различных концентрациях в наномолярном и микромолярном диапазоне в системе с течением времени, демонстрируя, что не было достигнуто ни насыщения на поверхности чипа, ни равновесного связывания.
Концентрация и реакция были построены для связывания CVN дикого типа с RBD, предполагая конкретное нацеливание на возможно сохраненные углеводы на субъединице RBD S1 с более слабым сродством, имеющей константу скорости диссоциации 260 мкмоль. Тот же график сродства для связывания CVN2L0-V4 с DM становится более неанализуемым из-за замены дисульфидных связей, которые препятствуют высокоаффинному связыванию с небольшими гликозилированными пептидами и дают более высокий отклик, чем максимальное значение ответа. Связывание CVN дикого типа с RBD на SARS-CoV-2 показывает связывание с S-белком и RBD с константой ярости диссоциации 18,6 мкмоль и 260 микромолей соответственно.
Хотя реакция SPR для концентраций анализируемого вещества приводит к высоким единицам отклика и типичным сенсорграммам SPR для CVN дикого типа и связывания E41A. Однако мутант нестабилен при разбавлении. Биозондирование SPR направлено на высокоаффинное и низкоаффинное связывание очищенных белков и их вариантов с лигандами.
В нашем случае гликопротеины, использующие оптические показания и двухканальную систему потока на поверхности чипа датчика. Иммуноферментный анализ представляет собой альтернативный иммунологический метод, распознающий белковые эпитопы, а также предоставляющий данные о концентрации пептидов и малых молекул из сложных матриц. Тестирование рекомбинантно экспрессированных белков с помощью SPR-связывающих анализов включало биозондирование подтверждающих изменений, что полезно для проверки и прогнозирования стабильности белка вычислительной стороной белка.
