检查斑马鱼肌肉疾病模型中的肌肉再生

本协议的总体目标是检查和量化肌肉疾病斑马鱼模型中的肌肉再生。这种方法提供了一个高通量管道，不仅具有成本效益，而且高度可重复得分生病的肌肉在体内设置的再生潜力。澳大利亚再生医学研究所的研究员阿夫妮卡·鲁帕雷利亚将和我一起演示这个程序。

对于活胚胎基因型，从24室DNA提取芯片的顶部剥离透明保护膜，并使用20微升滤尖端与切尖将胚胎介质的13微升单一麻醉胚胎移植到芯片的每个腔室中。当所有胚胎都装上时，轻轻地将芯片安装到斑马鱼胚胎基因型平台上，先放在一边，然后放在芯片的其余部分。在芯片上贴上磁平台盖，以防止胚胎介质在DNA提取过程中蒸发并关闭盖子。

将基座单位设置为 2.4 伏特、0.051 安培和 0.12 瓦，并启动 DNA 提取协议。平台应开始振动，可以通过轻轻触摸盖子来评估。在程序运行期间，通过在每口井中加入一毫升胚胎介质来准备一个24井的板材，并标记八井条管，用于收集每个胚胎的DNA材料。

提取8分钟后，按开/关按钮，停止平台的振动，轻轻取下磁盖，将芯片从平台上抬起。将10微升胚胎介质从一个腔室转移到八井带管的适当井中，并立即向腔室中加入两滴新鲜胚胎介质。将胚胎从腔室转移到先前准备好的24井板的合适井中。

当所有的胚胎都移植后，将板放在28摄氏度的孵化器中。对八井条管中收集的遗传物质进行适当的下游基因测定，以确定每个胚胎的基因型。一旦每个胚胎的基因型被识别出来，将胚胎转移到90毫米的培养皿中，含有25毫升的中等水，并在28摄氏度的温度下孵育板，直到肌肉受伤。

施肥后四天内，使用移液器将一只麻醉幼虫转移到新的培养皿中，并在解剖显微镜下小心地从菜中取出多余的介质。定向鱼，使头部在左边，尾巴在右边，多面体区域向上，腹腔区域下降，并使用30度针，使快速精确刺成一到两个吸血糖在腹腔孔上方的腹肌和水平到肌塞普图姆。将一滴胚胎介质涂抹到受伤的斑马鱼上，并小心地将幼虫转移到一口24井的盘子里，每口井含有一毫升新鲜胚胎介质。

当所有的幼虫都受伤时，将盘子放在28摄氏度的孵化器中，直到斑马鱼被成像。要量化肌肉再生，请在适当的图像分析软件程序中打开一天受伤后图像，并使用多边形工具在伤口部位周围绘制形状。使用该软件测量区域的面积和平均双面强度，并将这些值复制到所提供模板的单元格 D3 和 E3。

绘制两个额外的区域，每个区域跨越一到两个未受伤的烟头，并测量每个区域的面积和平均双侵权强度。将这些值复制到模板中的单元格 D4、D5、E4 和 E5。然后在受伤后三天的图像中重复对相同区域的测量。

当在所有图像中以同样的方式测量双面体时，通过将每个区域的平均双弗雷德强度除以其区域来计算每个区域的正常双弗雷德弗瑞斯。对于每个时间点，计算两个未受伤区域的平均正常双伤，为未受伤的肌肉提供参考点。为了确定受伤后第一天的肌肉损伤程度，将损伤区域的正常双伤除以未受伤区域的平均正常双伤。

为了确定肌肉再生的程度，将受伤后三天内损伤区域的正常双损程度除以现阶段未受伤区域的平均正常强度。最后，计算再生指数，将受伤后第三天肌肉再生程度的值除以受伤后第一天肌肉损伤程度的值。在这个具有代表性的分析中，从两只拉玛2异质斑马鱼之间的交叉处的一组胚胎被转移到DNA提取芯片上，随后被基因化。

虽然肌肉损伤导致受伤后第一天的双伤强度降低，但肌肉的成功再生会导致同一区域内双发性增加。值得注意的是，虽然野生型幼虫由于正常的肌肉模式而表现出均匀的双裂强度，但 Lama2 淘汰幼虫肌肉中的双裂强度是不均匀的，而且由于肌肉完整性降低，则极零星。观察到，野生类型和拉玛2缺乏幼虫都表明，与受伤后一天相比，受伤后三天的伤口部位的双面性强度显著增加，这表明肌肉已经再生。

再生指数的测定表明，与野生动物相比，拉玛2型幼虫的肌肉再生明显增加。虽然此协议将使我们能够识别肌肉疾病模型中肌肉再生能力的任何变化，但需要进行下游细胞和分子分析，以确定负责观察到的变化的机制。这种方法使我们能够识别受损的肌肉干细胞功能和相关利基元素的损伤如何有助于肌肉疾病发病机制，因此使我们能够识别新的疾病机制。