각막 투명성은 시력을 맑게하는 데 도움이됩니다. 병리학 적 맥락에서이 투명성은 도전이 될 수 있습니다. 병인 메커니즘을 연구하려면 인간 장기와 높은 유사성을 갖는 간단한 모델이 필요합니다.
이러한 측면에서 제브라 피쉬는 훌륭한 모델입니다. 그리고 이것은 제브라 피쉬의 각막 마모에 대한 첫 번째 자세한 설명입니다. 이 기술은 눈에 표면 진입을 유도하는 간단하고 빠른 방법입니다.
상처 폐쇄는 마모 후 쉽게 따라갈 수 있습니다. 또한 화학 물질 또는 특정 요인을 탱크 물에 추가하여 상처 폐쇄에 미치는 영향을 연구 할 수 있습니다. 상처가 수동으로 생성되기 때문에이 방법은 일관된 결과를 얻기 위해 몇 가지 연습이 필요합니다.
실험 전에 트리카인의 0.02 % 작업 용액을 준비하십시오. 0.4% 원액 2mL를 해동한다. 시스템 물 40 mL에 첨가하십시오.
그리고 용액을 작은 용기에 넣으십시오. 버 팁이 깨끗한지 확인하여 안과 버를 준비하십시오. 필요한 경우 촉촉한 면봉으로 세포 파편을 제거하십시오.
부드러운 스폰지의 측면을 절개하십시오. 그리고 스폰지를 시스템 물로 적셔주십시오. 스폰지를 해부 현미경의 무대에 놓습니다.
버 사용을위한 충분한 작업 공간을 확보하십시오. 그리고 눈 표면을 올바르게 볼 수있는 측면과 위의 조명이 충분합니다. 숟가락으로 마취 된 생선을 스폰지 표면에서 튀어 나온 머리로 스폰지의 절개에 부드럽게 놓습니다.
버 팁으로 눈 표면에 조심스럽게 접근하십시오. 그리고 원형 동작으로 눈 표면의 팁을 움직이기 시작하십시오. 찰과상이 끝나면 회복을 위해 진통제가 들어있는 신선한 시스템 물에 생선을 조심스럽게 넣으십시오.
촉촉한 면봉으로 사용 직후에 버를 청소하십시오. 원하는 시점에서 물고기를 집어 들고 0.02 % 트리카인 용액에 넣으십시오. 난관 운동이 완전히 멈추고 물고기가 만지는 것에 반응하지 않을 때까지 동물을 용액에 보관하십시오.
숟가락으로 페트리 접시에 물고기를 놓고 핀셋으로 잡으십시오. 해부하는 가위로 물고기를 감금하십시오. 눈 표면에 긁힌 자국을 피하십시오.
조직을 0.1 M 인산나트륨을 함유하는 샘플 튜브에 넣는다. 그리고 깨끗한 완충액으로 헹구어 용액에 혈액이 남지 않도록하십시오. 조직을 4C에서 24시간 동안 0.1 M 인산나트륨 중의 2.5%글루타르알데히드에 고정시키고 고정액을 제거하고 0.1 M 인산나트륨으로 샘플을 여러 번 헹구었다.
샘플을 해부 플레이트 상의 0.1 M 인산나트륨 방울 상에 놓아 해부한다. 미세한 해부 가위로 머리 샘플을 두 개로 자릅니다. 또는 미세한 핀셋의 끝을 눈의 측면에서 눈 소켓에 조심스럽게 배치하여 눈을 모으십시오.
그런 다음 소켓에서 눈을 뽑아 여분의 조직을 제거하십시오. 해부된 샘플을 0.1 M 인산나트륨을 함유하는 튜브로 옮긴다. 샘플 처리 중에 눈 꼭대기에 부착 될 수 있으므로 샘플 튜브에 여분의 조직이 없는지 확인하십시오.
탭이 있는 마운트를 홀더에 놓습니다. 및 해부 현미경의 기저부에 홀더를 포함한다. 미세한 핀셋으로 조직 샘플을 마운트에 부드럽게 올려 놓고 각막이 위를 향하게하십시오.
적절한 장치를 사용하여 시편을 백금으로 코팅하십시오. 샘플을 이미징할 때까지 실온에서 보관한다. 원하는 배율의 이미지를 가져옵니다.
그리고 분석을 위해 2000 ~ 2500x 이미지를 사용하십시오. 밝기와 대비를 조정하여 모든 셀 테두리와 마이크로 리지를 명확하게 볼 수 있습니다. 그리고 이미지에서 과다 노출 된 영역을 피하십시오.
피지 ImageJ 1.53으로 TIFF 이미지를 엽니다. 그리고 스케일 바를 사용하여 스케일을 설정하십시오. 선 도구를 사용하여 배율 표시줄과 같은 선을 만듭니다.
분석을 선택합니다. 그런 다음 배율을 설정합니다. 그리고 알려진 거리를 입력하십시오.
그런 다음 분석, 도구 메뉴를 사용하여 ROI 관리자를 엽니다. 셀 크기 및 원형성에서 분석, 측정 설정, 모양 설명자를 선택합니다. 그리고 돋보기 도구를 사용하여 배율 아래 세포를 볼 수 있습니다.
Polygon 도구를 사용하여 셀을 선택하고 각 선택 항목을 ROI 관리자에 추가합니다. 마지막으로, 선택된 세포를 측정하고, 측정을 저장한다. 마이크로리지 분석을 진행하려면 이미지, 유형 메뉴를 클릭하여 이미지가 8비트 형식인지 확인합니다.
그런 다음 Polygon 도구를 사용하여 셀을 선택합니다. 그리고 편집을 클릭 한 다음 외부 지우기를 클릭하여 배경을 지우십시오. [프로세스], [매끄럽게]를 선택하여 이미지를 한 세 번 매끄럽게 만듭니다.
그리고 이미지, 조정, 밝기 / 대비에서 밝기와 대비를 조정하여 마이크로 리지가 가능한 한 명확하게 눈에 띄도록하십시오. 프로세스, 필터, 컨볼브를 클릭하여 이미지를 컨볼브합니다. 그리고 프로세스, 바이너리, 바이너리 만들기를 클릭하여 바이너리로 변환하십시오.
그런 다음 프로세스, 바이너리, 스켈레네이션을 선택하여 흑백 이미지를 골격화합니다. 분석된 골격 함수를 사용하여 마이크로리지 파라미터를 측정하고 값을 저장합니다. 상처 부위는 상처 후 세 시간에 닫힙니다.
그러나 상처 경계가 결합 된 부위는 여전히 보입니다. 결과는 절제된 각막 상피 마이크로리지에서 상처 부위 옆의 일부 길쭉한 세포에서 관찰될 수 있음을 보여주었다. 일부 주변 영역에서, 마이크로리지는 세포의 중심으로부터 손실된다.
두 개의 주변 영역 사이의 비교는, 더 짧은 평균 마이크로리지를 갖는 길쭉한 세포를 나타냈으며, 이는 상처에 대한 반응으로서 세포 재배열을 나타낸다. 이러한 결과는 세포 형태 변화가 마이크로리지 변형과 상관관계가 있고 상처 반응에서 각막 상피 내의 이질성을 강조한다는 것을 시사한다. 수술은 균질하고 재현 가능한 상처를 수행하기 위해 훈련이 필요하다는 것을 기억하십시오.
전자 현미경 검사 외에도 조직은 조직학, 면역학 염색 및 계내 혼성화에 사용될 수 있습니다. 이들은 상처 치유 동안 세포 및 분자 변화에 대한 더 많은 통찰력을 제공 할 것입니다. 제브라피쉬를 사용하면 각막 생물학에 대한 우리의 지식이 넓어집니다.
또한,이 모델은 약리학 적 연구에 탁월하며 눈 진화에 대해 더 많이 이해하는 데 사용할 수 있습니다.
