שקיפות קרנית היא אינסטרומנטלית כדי לנקות את הראייה. בהקשר פתולוגי, שקיפות זו יכולה להיות אתגר. לימוד מנגנון פתוגנזה דורש מודלים פשוטים בעלי דמיון גבוה לאיבר האנושי.
בהיבטים אלה, דגי זברה הם מודל מצוין. וזה התיאור המפורט הראשון של שחיקה בקרנית בדגי זברה. טכניקה זו היא דרך פשוטה ומהירה לגרום לכניסה לפני השטח לעין.
ניתן לעקוב אחר סגירת הפצע בקלות לאחר שחיקה. כמו כן, כימיקלים, או גורמים ספציפיים, ניתן להוסיף למי הטנק כדי ללמוד את השפעתם על סגירת הפצע. כמו הפצע נוצר באופן ידני, השיטה דורשת קצת תרגול כדי להשיג תוצאות עקביות.
לפני הניסוי, הכן פתרון עבודה של 0.02%. להפשיר 2 מ"ל של 0.4% פתרון מניות. מוסיפים ל-40 מ"ל של מי מערכת.
ומניחים את הפתרון במיכל קטן. הכינו את בר העיניים על ידי בדיקה אם קצה הבר נקי. ואם יש צורך, להסיר פסולת תאים עם צמר גפן לח.
בצע חתך בצד של ספוג רך. ולהרטיב את הספוג עם מי מערכת. מניחים את הספוג על הבמה של מיקרוסקופ מנתח.
ודאו מספיק מקום עבודה לשימוש בבר. ומספיק הארה מהצד ומעלה כדי לראות את פני השטח של העין בצורה נכונה. מניחים בעדינות את הדג מרדים עם כף לתוך החתך על הספוג עם הראש בולט מפני השטח ספוג.
בזהירות להתקרב לפני השטח של העין עם קצה הבר. ולהתחיל להזיז את הקצה על פני השטח של העין בתנועה מעגלית. כאשר השחיקה נעשית, בזהירות למקם את הדגים במי המערכת הטריים המכילים משכך כאבים להתאוששות.
יש לנקות את הבר מיד לאחר השימוש עם צמר גפן לח. הרם את הדג בנקודת הזמן הרצויה ומקם אותו בתמיסת 0.02%tricaine. שמור על החיה בתמיסה עד שהתנועה האופרקולרית תיפסק לחלוטין והדגים לא יגיבו למגע.
מניחים את הדג על צלחת פטרי עם כפית, ומחזיקים אותו עם פינצטה. לערוף את ראשם של הדגים עם מספריים מנתחים. הימנע ביצוע שריטות על פני השטח של העין.
שים את הרקמה לתוך צינור מדגם המכיל 0.1 M נתרן פוספט. ולשטוף אותו עם חיץ נקי, כך שאין דם נשאר בתמיסה. לתקן את הרקמה ב 2.5% glutaraldehyde ב 0.1 M נתרן פוספט במשך 24 שעות ב 4 C.הסר את פתרון התיקון ולשטוף את המדגם מספר פעמים עם 0.1 M נתרן פוספט.
לנתח את המדגם על ידי הצבתו על טיפה של 0.1 M נתרן פוספט על צלחת ניתוח. חותכים את דגימת הראש לשניים עם מספריים מנתחים עדינים. לחלופין, לאסוף את העיניים על ידי הצבת בזהירות את קצות פינצטה בסדר לתוך ארובות העין מצד העין.
לאחר מכן, לשלוף את העין מן השקע ולהסיר רקמה נוספת. העבר את הדגימה המנותחת לתוך צינור המכיל 0.1 M נתרן פוספט. ודא שאין רקמה נוספת בצינור המדגם, כפי שהוא עשוי לדבוק בחלק העליון של העין במהלך עיבוד מדגם.
מקם את הטעינה עם הכרטיסייה על מחזיק. והמחזיק בבסיס של מיקרוסקופ מנתח. מניחים בעדינות את דגימת הרקמה על ההר עם פינצטה עדינה, קרנית פונה כלפי מעלה.
מצופה את הדגימה בפלטינה באמצעות המכשיר המתאים. ולאחסן את הדגימות בטמפרטורת החדר עד הדמיה. השג תמונות של ההגדלה הרצויה.
ולהשתמש תמונות 2000 עד 2500x לניתוח. התאם את הבהירות והניגודיות כדי לראות בבירור את כל גבולות התא והמיקרו-רידג'ים. והימנעו מחשיפת יתר של אזורים בתמונה.
פתח את תמונת TIFF עם פיג'י ImageJ 1.53. והשתמש בסרגל קנה מידה כדי להגדיר את קנה המידה. צרו קו השווה לסרגל קנה המידה בעזרת הכלי קו.
בחר נתח. לאחר מכן, הגדר קנה מידה. והקלד את המרחק הידוע.
לאחר מכן, פתח את מנהל ההחזר על ההשקעה באמצעות תפריט ניתוח, כלים. עבור גודל התא והעגלות, בחר נתח, הגדר מידות, מתארי צורה. והשתמשו בכלי זכוכית מגדלת כדי לראות את התאים תחת הגדלה.
בחרו תאים בעזרת הכלי מצולע והוסיפו כל בחירה למנהל ההחזר על ההשקעה. לבסוף, מדוד את התאים שנבחרו ושמור את המדידה. כדי להמשיך בניתוח microridge, ודא שהתמונה היא בתבנית של 8 סיביות על-ידי לחיצה על תפריט תמונה, סוג.
לאחר מכן, בחרו בתא בעזרת הכלי מצולע. ונקה את הרקע על-ידי לחיצה על ערוך ולאחר מכן נקה בחוץ. החלק את התמונה פעם עד שלוש פעמים על-ידי בחירה באפשרות 'תהליך', 'החלק'.
והתאמו את הבהירות והניגודיות מ-Image, Adjust, Brightness/Contrast, כך שהמיקרו-רידג'ים יבלטו בצורה ברורה ככל האפשר. סובב את התמונה על ידי לחיצה על תהליך, מסננים, סובבים. ולהפוך אותו בינארי על ידי לחיצה על תהליך, בינארי, הפוך בינארי.
לאחר מכן, שלד את התמונה בשחור לבן על-ידי בחירת תהליך, בינארי, שלד. השתמש בפונקציה שלד מנותח כדי למדוד את הפרמטרים microridge ולשמור את הערכים. אזור הפצע סגור בשלוש שעות לאחר הפציעה.
אבל האתר שבו גבולות הפצע מחוברים נשאר גלוי. התוצאות הראו כי על מיקרורידיום אפיתל הקרנית משופשף ניתן לראות בכמה תאים מוארכים ליד אתר הפצע. באזורים היקפיים מסוימים, המיקרורכסים הולכים לאיבוד ממרכז התא.
השוואה בין שני האזורים ההיקפיים, הראתה תאים מוארכים עם מיקרורידג'ים ממוצעים קצרים יותר, מה שמצביע על סידור מחדש של תאים כתגובה לפציעה. תוצאות אלה מצביעות על כך ששינויים בצורת התא מתואמים עם שינוי מיקרורידג ' ומדגישים את ההטרוגניות בתוך אפיתל הקרנית בתגובת הפצע. זכור כי הניתוח דורש אימון כדי לבצע פצע הומוגני לשחזור.
בנוסף למיקרוסקופיה אלקטרונית, הרקמה יכולה לשמש להיסטולוגיה, כתמים אימונולוגיים והכלבה במקום. אלה יספקו תובנה נוספת בתא ושינויים מולקולריים במהלך ריפוי הפצע. שימוש בדגי זברה מרחיב את הידע שלנו בביולוגיה של הקרנית.
יתר על כן, מודל זה מצוין למחקרים פרמקולוגיים, וניתן להשתמש בו כדי להבין יותר על התפתחות העין.
