Die Transparenz der Hornhaut ist für eine klare Sicht von entscheidender Bedeutung. Im pathologischen Kontext kann diese Transparenz eine Herausforderung sein. Die Untersuchung des Pathogenesemechanismus erfordert einfache Modelle mit einer hohen Ähnlichkeit mit dem menschlichen Organ.
In diesen Aspekten ist der Zebrafisch ein hervorragendes Modell. Und dies ist die erste detaillierte Beschreibung des Hornhautabriebs bei Zebrafischen. Diese Technik ist eine einfache und schnelle Möglichkeit, den Oberflächeneintritt in das Auge zu induzieren.
Der Wundverschluss kann nach dem Abrieb leicht nachverfolgt werden. Auch Chemikalien oder spezifische Faktoren können dem Tankwasser hinzugefügt werden, um ihre Auswirkungen auf den Wundverschluss zu untersuchen. Da die Wunde manuell erstellt wird, erfordert die Methode etwas Übung, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.
Bereiten Sie vor dem Experiment eine 0,02% ige Arbeitslösung von Tricain vor. Tauen Sie 2 ml 0,4%ige Lagerlösung auf. Fügen Sie zu 40 ml Systemwasser hinzu.
Und legen Sie die Lösung in einen kleinen Behälter. Halten Sie den Augengrat bereit, indem Sie überprüfen, ob die Gratspitze sauber ist. Und wenn nötig, entfernen Sie Zellablagerungen mit einem feuchten Wattestäbchen.
Machen Sie einen Schnitt an der Seite eines weichen Schwammes. Und befeuchten Sie den Schwamm mit Systemwasser. Legen Sie den Schwamm auf den Tisch eines Seziermikroskops.
Stellen Sie sicher, dass genügend Arbeitsraum für die Verwendung des Grats vorhanden ist. Und genug Beleuchtung von der Seite und von oben, um die Augenoberfläche richtig zu sehen. Legen Sie den betäubten Fisch vorsichtig mit einem Löffel in den Schnitt auf dem Schwamm, wobei der Kopf aus der Schwammoberfläche herausragt.
Nähern Sie sich vorsichtig der Augenoberfläche mit der Gratspitze. Und fangen Sie an, die Spitze auf der Augenoberfläche mit einer kreisförmigen Bewegung zu bewegen. Wenn der Abrieb abgeschlossen ist, legen Sie den Fisch vorsichtig in das frische Systemwasser, das Analgetika zur Erholung enthält.
Reinigen Sie den Grat sofort nach Gebrauch mit einem feuchten Wattestäbchen. Nehmen Sie den Fisch zum gewünschten Zeitpunkt auf und legen Sie ihn in 0,02% ige Tricain-Lösung. Halten Sie das Tier in der Lösung, bis die operkuläre Bewegung vollständig aufgehört hat und der Fisch nicht auf Berührungen reagiert.
Legen Sie den Fisch mit einem Löffel auf eine Petrischale und halten Sie ihn mit einer Pinzette. Enthaupten Sie den Fisch mit einer Sezierschere. Vermeiden Sie Kratzer auf der Augenoberfläche.
Geben Sie das Gewebe in ein Probenröhrchen, das 0,1 M Natriumphosphat enthält. Und spülen Sie es mit einem sauberen Puffer ab, damit kein Blut in der Lösung verbleibt. Fixieren Sie das Gewebe in 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumphosphat für 24 Stunden bei 4 ° C. Entfernen Sie die Fixierlösung und spülen Sie die Probe mehrmals mit 0,1 M Natriumphosphat.
Sezieren Sie die Probe, indem Sie sie auf einen Tropfen 0,1 M Natriumphosphat auf einer Sezierplatte legen. Schneiden Sie die Kopfprobe mit einer feinen Sezierschere in zwei Teile. Alternativ können Sie die Augen einsammeln, indem Sie die Spitzen einer feinen Pinzette von der Seite des Auges vorsichtig in die Augenhöhlen legen.
Ziehen Sie dann das Auge aus der Augenhöhle und entfernen Sie zusätzliches Gewebe. Die sezierte Probe wird in ein Röhrchen mit 0,1 M Natriumphosphat überführt. Stellen Sie sicher, dass sich kein zusätzliches Gewebe im Probenröhrchen befindet, da es während der Probenverarbeitung an der Oberseite des Auges haften bleiben kann.
Platzieren Sie die Halterung mit der Lasche auf einer Halterung. Und der Halter an der Basis eines Seziermikroskops. Legen Sie die Gewebeprobe vorsichtig mit einer feinen Pinzette auf die Montierung, die Hornhaut nach oben.
Beschichten Sie die Probe mit dem entsprechenden Gerät mit Platin. Und lagern Sie die Proben bei Raumtemperatur bis zur Bildgebung. Erfassen Sie Bilder der gewünschten Vergrößerung.
Und verwenden Sie 2000 bis 2500x Bilder für die Analyse. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast an, um alle Zellränder und Mikrokamme deutlich zu sehen. Und vermeiden Sie überbelichtete Bereiche im Bild.
Öffnen Sie das TIFF-Bild mit Fiji ImageJ 1.53. Und verwenden Sie eine Skalierungsleiste, um die Skala einzustellen. Erstellen Sie mit dem Linienwerkzeug eine Linie, die der Maßstabsleiste entspricht.
Wählen Sie Analysieren aus. Legen Sie dann die Skalierung fest. Und geben Sie in der bekannten Entfernung ein.
Öffnen Sie dann den ROI-Manager über das Menü Analysieren, Extras. Für Zellgröße und Rundheit wählen Sie Analysieren, Messungen festlegen, Formdeskriptoren. Und verwenden Sie das Lupenwerkzeug, um die Zellen unter Vergrößerung zu sehen.
Markieren Sie Zellen mit dem Polygon-Werkzeug und fügen Sie jede Auswahl dem ROI-Manager hinzu. Messen Sie abschließend die ausgewählten Zellen und speichern Sie die Messung. Um mit der Mikrokammanalyse fortzufahren, stellen Sie sicher, dass das Bild im 8-Bit-Format vorliegt, indem Sie auf das Menü Bild eingeben klicken.
Wählen Sie dann die Zelle mit dem Polygon-Werkzeug aus. Und löschen Sie den Hintergrund, indem Sie auf Bearbeiten und dann auf Außerhalb löschen klicken. Glätten Sie das Bild ein- bis dreimal, indem Sie Verarbeiten, Glätten auswählen.
Und passen Sie die Helligkeit und den Kontrast von Bild, Anpassen, Helligkeit / Kontrast an, so dass die Mikrokämme so deutlich wie möglich hervorstechen. Verdrehen Sie das Bild, indem Sie auf Verarbeiten, Filtern, Volvieren klicken. Und verwandeln Sie es in binär, indem Sie auf Prozess, Binär, Binär erstellen klicken.
Skelettieren Sie dann das Schwarz-Weiß-Bild, indem Sie Verarbeiten, Binär, Skelettieren auswählen. Verwenden Sie die Funktion Analysiertes Skelett, um die Mikrokammparameter zu messen und die Werte zu speichern. Der Wundbereich ist drei Stunden nach der Wunde geschlossen.
Aber die Stelle, an der die Wundgrenzen verbunden sind, bleibt sichtbar. Die Ergebnisse zeigten, dass auf abgeschliffenem Hornhautepithel Mikrokamme in einigen länglichen Zellen neben der Wundstelle beobachtet werden können. In einigen peripheren Regionen gehen die Mikrokämme aus dem Zentrum der Zelle verloren.
Ein Vergleich zwischen den beiden peripheren Regionen zeigte längliche Zellen mit kürzeren durchschnittlichen Mikrokämmen, was auf Zellumlagerungen als Reaktion auf Wunden hinweist. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Zellformänderungen mit der Mikrokammmodifikation korrelieren und die Heterogenität innerhalb des Hornhautepithels in der Wundreaktion betonen. Denken Sie daran, dass die Operation Training erfordert, um eine homogene und reproduzierbare Wunde durchzuführen.
Neben der Elektronenmikroskopie kann das Gewebe für die Histologie, immunologische Färbungen und die In-situ-Hybridisierung verwendet werden. Diese werden weitere Einblicke in die Zelle und molekulare Veränderungen während der Wundheilung liefern. Die Verwendung von Zebrafisch erweitert unser Wissen über die Hornhautbiologie.
Darüber hinaus eignet sich dieses Modell hervorragend für pharmakologische Studien und kann verwendet werden, um mehr über die Entwicklung der Augen zu erfahren.
