该协议提供了一种高通量技术来研究DNA和配体之间的分子间结合。该技术在大量生物分子结构的研究中已显示出高通量。它通过将单个分子的机械化学性质转换为分子集合的机械化学性质来实现。
我认为这是一个非常向前迈出的实验，但几乎没有关键的步骤。例如，显微镜、均质器和反应管的对准。这三件事应该完美对齐，以便准确跟踪荧光的变化。
首先将均质器和显微镜组装在安装台上。戴上护目镜后，打开荧光显微镜，然后调整均质器，确保激发光束穿过均质器分散尖端的中心。然后准备一个高5厘米，横截面为1.5×1.5平方厘米的平底反应室，确保所选的室材料不会发出荧光以减少背景。
然后，将反应室夹在荧光显微镜的样品台上，然后调整室以保持均质器的分散尖端，确保尖端略高于反应室的底面。接下来，一起调整均质器和腔室的垂直位置，以确保显微镜的焦点在分散尖端的表面上。然后调整分散头的水平位置，确保在转子和定子之间设置检测区域。
打开荧光通道，根据实验中使用的荧光染料。在高速剪切实验之前，使用去离子水测试低剪切速度的剪切。首先，如手稿中所述，在去离子水中分别在其两端用染料和淬灭剂标记的人端粒i-motif DNA。
接下来，在pH 5.5或pH 7.4的30毫摩尔MES缓冲液中将DNA稀释至5微摩尔。向DNA溶液中，加入0至60微摩尔浓度范围内的配体L2H24OTD“，轻轻混合溶液10分钟，以在没有光的情况下折叠i-motif结构。使用荧光显微镜检查并最小化充满去离子水的反应室的背景荧光强度，而无需剪切。
然后使用软件设置CCD相机的参数，曝光时间为0.5秒，CCD感光度为1， 600，记录时间等于20分钟。使用长移液管将DNA溶液加入空且干净的反应室中，并用黑匣子盖住反应室。然后启动均质机，以选定的剪切速率从每秒9， 724到每秒97， 245进行剪切，持续20分钟，打开CCD相机记录数据。
实验结束后，取出腔室并用去离子水洗涤。准备i-motif DNA和去离子水。然后，孵育 10 微摩尔 i-motif DNA 和 300 μL 30 毫摩尔 tris 缓冲液，补充有 150 微摩尔氯化铜和 300 微摩尔抗坏血酸 10 分钟以折叠 i-motif 结构。
接下来用超滤装置以14，300倍G的离心力超滤溶液.每次过滤后用补充有300微摩尔抗坏血酸的30毫摩尔tris缓冲液将溶液补充至约500微升。收集残留溶液后，通过加入补充有 300 微摩尔抗坏血酸的 30 毫摩尔 tris 以及 20 微摩尔 CalFluor 488 叠氮化物、20 微摩尔 HPG 和 10 微摩尔 TBTA 制成 300 微升的最终体积。添加试剂后，将溶液移至暗室。
然后在剪切实验之前使用显微镜检查并最小化充满去离子水的反应室的背景荧光强度。接下来，用长移液管将DNA溶液加入空的反应室中，然后在CCD相机打开的情况下，以每秒63，209的剪切速率启动均质机剪切20分钟。实验结束后，取出腔室并用去离子水洗涤。
在pH 5.5 MES缓冲液中，观察到i-motif DNA的荧光强度随着每秒9， 724到每秒97， 245的绝对速率而增加。然而，当以每秒63， 209的速率剪切相同的i-motif DNA时，荧光强度没有增加，因为它在MES缓冲液中的pH 7.4下不会折叠。评估了在纯流动下与DNA i-motif分子的配体结合，结果表明荧光强度的增加随着配体浓度的增加而变得不那么明显。
确定配体和i基序之间相互作用的解离常数，发现为34微摩尔。铜一螯合i基序以每秒63， 209的剪切速率展开，释放的铜基序触发荧光点击反应，导致荧光强度随时间增加。首先，确保检测区域设置在转子和定子之间。
其次，检查并尽量减少荧光背景。最后，确保在执行点击反应之前过滤反应。这种方法为探索机械强度、折叠和展开各种聚合物打开了大门。
它可能是其他DNA结构，蛋白质或其他聚合物，以及它们与其他类型的分子的相互作用。如前所述，可以使用这种方法研究其他几种大分子。
