פרוטוקול זה מספק טכניקת תפוקה גבוהה לחקר הקשירה הבין-מולקולרית בין דנ"א לליגנדים. טכניקה זו הדגימה תפוקה גבוהה בחקר קבוצה מסיבית של מבנים ביומולקולריים. הוא עושה זאת על ידי המרת התכונות הכימיות המכניות של מולקולות בודדות לאלה של הרכבים מולקולריים.
אני חושב שזה ניסוי מאוד צעד קדימה אבל יש כמה צעדים קריטיים. לדוגמה, יישור של מיקרוסקופ, הומוגנייזר, ואת צינור התגובה. שלושת הדברים האלה צריכים להיות מיושרים בצורה מושלמת על מנת לעקוב במדויק אחר השינוי בפלואורסצנציה.
מתחילים בהרכבת ההומוגנייזר והמיקרוסקופ על שולחן הרכבה. לאחר הרכבת משקפי מגן, הפעל את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי ולאחר מכן כוונן את ההומוגנייזר כדי לוודא שקרן האור העירור עוברת דרך מרכז הקצה המתפזר של ההומוגנייזר. לאחר מכן הכינו תא תגובה בעל תחתית שטוחה שגובהו חמישה סנטימטרים ו-1.5 על 1.5 סנטימטרים רבועים בחתך רוחב, כדי להבטיח שחומר התא שנבחר לא יפחית את הרקע.
לאחר מכן, מהדקים את תא התגובה בשלב הדגימה של המיקרוסקופ הפלואורסצנטי ולאחר מכן מתאימים את התא כך שיחזיק את קצה הפיזור של ההומוגנייזר, כדי להבטיח שהקצה יהיה מעט מעל המשטח התחתון של תא התגובה. לאחר מכן, התאם את המיקום האנכי של ההומוגנייזר והתא יחד כדי להבטיח שהמיקוד של המיקרוסקופ יהיה על פני השטח של קצה הפיזור. לאחר מכן התאם את המיקום האופקי של קצה הפיזור כדי לוודא שאזור הזיהוי מוגדר בין הרוטור למצב.
הפעל את ערוצי הפלואורסצנט, על פי הצבע הפלואורסצנטי ששימש בניסוי. לפני ניסוי הגזירה במהירות גבוהה, השתמשו במים שעברו דה-יוניזציה כדי לבחון את הגזירה במהירות גזירה נמוכה. ראשית, הכינו דנ"א טלומרי אנושי בעל מוטיב המסומן בצבע ובקוונצ'ר בשני קצותיו בהתאמה במים שעברו דה-יוניזציה כפי שמתואר בכתב היד.
לאחר מכן, דללו את הדנ"א לחמישה מיקרומולרים במאגר MES של 30 מילימולאר ב-pH 5.5 או pH 7.4. לתמיסת הדנ"א, הוסיפו ליגנד L2H24OTD"בטווח ריכוזים של אפס עד 60 מיקרומולר וערבבו את התמיסה בעדינות במשך 10 דקות כדי לקפל את מבני ה-i-motif ללא אור. בדוק ומזער את עוצמת הפלואורסצנטיות ברקע של תא התגובה המלא במים שעברו דה-יוניזציה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ללא גזירה.
לאחר מכן הגדר את הפרמטרים של מצלמת ה- CCD באמצעות התוכנה עם זמן חשיפה של 0.5 שניות, רגישות CCD של 1, 600 וזמן הקלטה השווה ל -20 דקות. באמצעות פיפטה ארוכה, מוסיפים את תמיסת הדנ"א לתא התגובה הריק והנקי ומכסים את תא התגובה בקופסה שחורה. לאחר מכן התחל את ההומוגנייזר לבצע גזירה בקצב גזירה נבחר הנע בין 9, 724 לשנייה ל -97, 245 לשנייה למשך 20 דקות, כאשר מצלמת ה- CCD מופעלת כדי להקליט את הנתונים.
לאחר הניסוי, הסר את התא ושטוף אותו במים שעברו דה-יוניזציה. הכן דנ"א i-motif ומים שעברו דה-יוניזציה. לאחר מכן, דגרו 10 דנ"א מיקרומולרי i-motif ו-300 מיקרוליטרים של 30 מילימולאר טריס בופר בתוספת 150 מיקרומולאר קופריק כלוריד ו-300 מיקרומולאר חומצה אסקורבית למשך 10 דקות כדי לקפל את מבני ה-i-motif.
הבא אולטרה לסנן את התמיסה עם מכשיר סינון אולטרה בכוח צנטריפוגלי של 14, 300 פעמים G.לחדש את התמיסה לכ 500 microliters עם 30 מילימולר tris buffers בתוספת 300 micromolar חומצה אסקורבית לאחר כל סינון. לאחר איסוף התמיסה השיורית, צור נפח סופי של 300 מיקרוליטר על ידי הוספת 30 מיקרומולאר טריס בתוספת 300 מיקרומולר חומצה אסקורבית יחד עם 20 מיקרומולאר CalFluor 488 אזיד, 20 מיקרומולאר HPG ו-10 מיקרומולאר TBTA. לאחר הוספת הריאגנטים, העבירו את הפתרון לחדר החושך.
לאחר מכן בדקו ומזערו את עוצמת הפלואורסצנטיות ברקע של תא התגובה המלא במים שעברו דה-יוניזציה באמצעות המיקרוסקופ לפני ניסויי הגזירה. לאחר מכן, הוסף את תמיסת הדנ"א לתא התגובה הריק עם פיפטה ארוכה, ולאחר מכן התחל את הטיית ההומוגנייזר בקצב גזירה של 63, 209 לשנייה למשך 20 דקות כאשר מצלמת ה- CCD מופעלת. לאחר הניסוי, הסר את התא ושטוף אותו במים שעברו דה-יוניזציה.
עוצמת הפלואורסצנטיות של דנ"א i-motif נצפתה עולה עם הקצב העצום שנע בין 9, 724 לשנייה ל-97, 245 לשנייה במאגר pH 5.5 MES. עם זאת, עוצמת הפלואורסצנציה לא עלתה כאשר אותו דנ"א של מוטיב i נגזל בקצב של 63, 209 לשנייה, מכיוון שהוא אינו מתקפל ב- pH 7.4 במאגר MES. הליגנד נקשר למולקולות ה-i-motif של הדנ"א הנתון לזרימה העצומה הוערך אשר הראה כי תוספת עוצמת הפלואורסצנטיות נעשתה פחות ברורה עם העלייה בריכוז הליגנד.
קבוע הדיסוציאציה נקבע עבור האינטראקציה בין הליגנד לבין מוטיב ה-i ונמצא כ-34 מיקרומולים. מוטיב הנחושת של כלאט אחד נפרש בקצב גזירה של 63, 209 לשנייה, והנחושת ששוחררה עוררה את תגובת הקליק הפלואורגנית, וכתוצאה מכך עוצמת הפלואורסצנטיות גדלה עם הזמן. ראשית, ודא כי אזור הזיהוי מוגדר בין הרוטור לבין stater.
שנית, בדקו ומזערו את הרקע הפלואורסצנטי. ולבסוף, הקפד לסנן את התגובה לפני שתבצע תגובת לחיצה. שיטה זו פותחת שער לחקור את החוזק המכני, לקפל ולפתוח את כל סוגי הפולימרים.
זה יכול להיות מבנים אחרים של דנ"א, חלבונים או פולימרים אחרים, והאינטראקציה שלהם עם סוגים אחרים של מולקולות. כאמור, ניתן לחקור מספר מקרומולקולות אחרות באמצעות גישה זו.
