Bu protokol, DNA ve ligandlar arasındaki moleküller arası bağlanmayı incelemek için yüksek verimli bir teknik sağlar. Bu teknik, büyük biyomoleküler yapı setinin araştırılmasında yüksek verim göstermiştir. Bunu, bireysel moleküllerin mekanik kimyasal özelliklerini moleküler toplulukların özelliklerine dönüştürerek yapar.
Bunun çok ileri bir adım olduğunu düşünüyorum, ancak kritik olarak birkaç adım var. Örneğin, mikroskop, homojenizatör ve reaksiyon tüpünün hizalanması. Floresandaki değişimi doğru bir şekilde izlemek için bu üç şey mükemmel bir şekilde hizalanmalıdır.
Homojenizatörü ve mikroskobu bir montaj tablasına monte ederek başlayın. Gözlük taktıktan sonra, floresan mikroskobu açın ve ardından uyarma ışık demetinin homojenizatörün dağılma ucunun merkezinden geçtiğinden emin olmak için homojenizatörü ayarlayın. Ardından, beş santimetre yüksekliğinde ve enine kesitte 1,5 x 1,5 santimetrekare olan düz tabanlı bir reaksiyon odası hazırlayın ve seçilen oda malzemesinin arka planı azaltmak için floresan yapmamasını sağlayın.
Daha sonra, reaksiyon odasını floresan mikroskobun numune aşamasında kelepçeleyin ve ardından hazneyi homojenizatörün dispersiyon ucunu tutacak şekilde ayarlayarak ucun reaksiyon odasının alt yüzeyinin biraz üzerinde olmasını sağlayın. Daha sonra, mikroskopun odağının dispersiyon ucunun yüzeyinde olduğundan emin olmak için homojenizatörün ve haznenin dikey konumunu birlikte ayarlayın. Ardından, algılama alanının rotor ve stater arasında ayarlandığından emin olmak için dağılım ucunun yatay konumunu ayarlayın.
Deneyde kullanılan floresan boyaya göre floresan kanallarını açın. Yüksek hızlı kesme deneyinden önce, kesmeyi düşük kesme hızıyla test etmek için deiyonize su kullanıldı. İlk olarak, el yazmasında açıklandığı gibi deiyonize suda sırasıyla iki ucunda bir boya ve bir söndürücü ile etiketlenmiş bir insan telomerik i-motif DNA'sı hazırlayın.
Daha sonra, DNA'yı pH 5.5 veya pH 7.4'te 30 milimolar MES tamponunda beş mikromolara seyreltin. DNA çözeltisine, sıfır ila 60 mikromolar konsantrasyon aralığında ligand L2H24OTD" ekleyin ve i-motif yapılarını ışıksız katlamak için çözeltiyi 10 dakika boyunca hafifçe karıştırın. Floresan mikroskobu kullanarak deiyonize suyla doldurulan reaksiyon odasının arka plan floresan yoğunluğunu kesmeden kontrol edin ve en aza indirin.
Ardından, yazılımı kullanarak CCD kameranın parametrelerini pozlama süresi 0,5 saniye, CCD hassasiyeti 1.600 ve kayıt süresi 20 dakikaya eşit olacak şekilde ayarlayın. Uzun bir pipet kullanarak, DNA çözeltisini boş ve temiz reaksiyon odasına ekleyin ve reaksiyon odasını kara bir kutu ile örtün. Ardından, verileri kaydetmek için CCD kamera açıkken 20 dakika boyunca saniyede 9.724 ila 97.245 arasında değişen seçilmiş bir kesme hızında kesme gerçekleştirmek için homojenizatörü çalıştırın.
Deneyden sonra, odayı çıkarın ve deiyonize suyla yıkayın. İ-motif DNA ve deiyonize su hazırlayın. Daha sonra, i-motif yapılarını katlamak için 10 dakika boyunca 10 mikromolar i-motif DNA'sını ve 150 mikromolar cupric klorür ve 300 mikromolar askorbik asit ile desteklenmiş 300 mikrolitre 30 milimolar tris tamponunu inkübe edin.
Daha sonra çözeltiyi 14.300 kat santrifüj kuvvetinde bir ultra filtreleme cihazı ile ultra filtreleyin G.Her filtrasyondan sonra 300 mikromolar askorbik asit ile desteklenmiş 30 milimolar tris tamponu ile çözeltiyi yaklaşık 500 mikrolitreye doldurun. Artık çözeltiyi topladıktan sonra, 20 mikromolar CalFluor 488 Azide, 20 mikromolar HPG ve 10 mikromolar TBTA ile birlikte 300 mikromolar askorbik asit ile desteklenmiş 30 milimolar tris ekleyerek 300 mikrolitrelik son bir hacim oluşturun. Reaktifler eklendikten sonra, çözeltiyi karanlık odaya taşıyın.
Ardından, kesme deneylerinden önce mikroskop kullanarak deiyonize suyla dolu reaksiyon odasının arka plan floresan yoğunluğunu kontrol edin ve en aza indirin. Daha sonra, DNA çözeltisini uzun bir pipetle boş reaksiyon odasına ekleyin ve ardından homojenizatörün CCD kamera açıkken 20 dakika boyunca saniyede 63.209 kesme hızında kesilmesini başlatın. Deneyden sonra, odayı çıkarın ve deiyonize suyla yıkayın.
i-motif DNA'nın floresan yoğunluğunun, pH 5.5 MES tamponunda saniyede 9.724 ila saniyede 97.245 arasında değişen saf bir hızla arttığı gözlenmiştir. Bununla birlikte, aynı i-motif DNA'sı saniyede 63.209 oranında kesildiğinde floresan yoğunluğu artmamıştır, çünkü MES tamponunda pH 7.4'te katlanmaz. Saf akışa maruz kalan DNA i-motif moleküllerine ligand bağlanması değerlendirildi, bu da floresan yoğunluğunun artışının artan ligand konsantrasyonu ile daha az belirgin hale geldiğini gösterdi.
Ligand ve i-motif arasındaki etkileşim için ayrışma sabiti belirlendi ve 34 mikromol olduğu bulundu. Bakır olan şelatlı i-motif, saniyede 63.209 kesme hızında açıldı ve serbest bırakılan bakır, florjenik tıklama reaksiyonunu tetikledi ve zamanla floresan yoğunluğunun artmasına neden oldu. İlk olarak, algılama alanının rotor ve stater arasında ayarlandığından emin olun.
İkincisi, floresan arka planını kontrol edin ve en aza indirin. Son olarak, tıklama reaksiyonu gerçekleştirmeden önce reaksiyonu filtrelediğinizden emin olun. Bu yöntem, mekanik mukavemeti keşfetmek, her türlü polimeri katlamak ve açmak için bir ağ geçidi açar.
Diğer DNA yapıları, proteinler veya diğer polimerler ve bunların diğer molekül türleriyle etkileşimleri olabilir. Söylendiği gibi, bu yaklaşım kullanılarak birkaç başka makromolekül incelenebilir.
