Este protocolo fornece uma técnica de alto rendimento para estudar a ligação intermolecular entre o DNA e os ligantes. Esta técnica demonstrou alto rendimento na investigação de um conjunto maciço de estruturas biomoleculares. Ele faz isso convertendo as propriedades químicas mecânicas de moléculas individuais em propriedades de conjuntos moleculares.
Acho que é um experimento muito avançado, mas há poucos passos críticos. Por exemplo, o alinhamento do microscópio, homogeneizador e do tubo de reação. Essas três coisas devem estar perfeitamente alinhadas para rastrear com precisão a mudança na fluorescência.
Comece montando o homogeneizador e o microscópio em uma mesa de montagem. Depois de usar os óculos, ligue o microscópio de fluorescência e, em seguida, ajuste o homogeneizador para se certificar de que o feixe de luz de excitação passe pelo centro da ponta de dispersão do homogeneizador. Em seguida, prepare uma câmara de reação de fundo plano com cinco centímetros de altura e 1,5 por 1,5 centímetros quadrados de seção transversal, garantindo que o material da câmara selecionado não fluoresce para reduzir o fundo.
Depois, prenda a câmara de reação no estágio de amostra do microscópio de fluorescência e, em seguida, ajuste a câmara para segurar a ponta de dispersão do homogeneizador, garantindo que a ponta esteja ligeiramente acima da superfície inferior da câmara de reação. Em seguida, ajuste a posição vertical do homogeneizador e da câmara juntos para garantir que o foco do microscópio esteja na superfície da ponta de dispersão. Em seguida, ajuste a posição horizontal da ponta de dispersão para garantir que a área de detecção esteja definida entre o rotor e o stater.
Ligue os canais fluorescentes, de acordo com o corante fluorescente usado no experimento. Antes do experimento de cisalhamento de alta velocidade, usava-se água deionizada para testar a cisalhamento com uma baixa velocidade de cisalhamento. Primeiro, prepare um DNA telomeric i-motif humano marcado com um corante e um quencher em suas duas extremidades, respectivamente, em água deionizada, conforme descrito no manuscrito.
Em seguida, dilua o DNA para cinco micromolares em tampão MES de 30 milimolares a pH 5,5 ou pH 7,4. À solução de ADN, adicionar o ligante L2H24OTD" num intervalo de concentração de zero a 60 micromolares e misturar a solução suavemente durante 10 minutos para dobrar as estruturas i-motif sem luz. Verifique e minimize a intensidade de fluorescência de fundo da câmara de reação que é preenchida com água deionizada usando o microscópio fluorescente sem cisalhamento.
Em seguida, defina os parâmetros da câmera CCD usando o software com tempo de exposição como 0,5 segundos, sensibilidade CCD de 1, 600 e tempo de gravação igual a 20 minutos. Usando uma pipeta longa, adicione a solução de DNA na câmara de reação vazia e limpa e cubra a câmara de reação com uma caixa preta. Em seguida, inicie o homogeneizador para realizar a cisalhamento a uma taxa de cisalhamento selecionada variando de 9, 724 por segundo a 97, 245 por segundo por 20 minutos, com a câmera CCD ligada para gravar os dados.
Após o experimento, remova a câmara e lave-a com água deionizada. Prepare o DNA i-motif e a água deionizada. Em seguida, incubar 10 micromolares de DNA i-motif e 300 microlitros de tampão tris milimolar suplementado com 150 cloreto cúprico micromolar e 300 ácido ascórbico micromolar por 10 minutos para dobrar as estruturas i-motif.
Em seguida, ultrafiltre a solução com um dispositivo de ultrafiltração a uma força centrífuga de 14, 300 vezes G.Reabasteça a solução para aproximadamente 500 microlitros com 30 tampões tris milimolares suplementados com 300 ácidos ascórbicos micromolares após cada filtração. Após a coleta da solução residual, faça um volume final de 300 microlitros adicionando 30 tris milimolares suplementados com 300 ácido ascórbico micromolar juntamente com 20 CalFluor 488 Azida micromolar, 20 HPG micromolares e 10 TBTA micromolar. Uma vez que os reagentes são adicionados, mova a solução para a sala escura.
Em seguida, verifique e minimize a intensidade de fluorescência de fundo da câmara de reação preenchida com água deionizada usando o microscópio antes dos experimentos de cisalhamento. Em seguida, adicione a solução de DNA na câmara de reação vazia com uma pipeta longa e, em seguida, inicie o cisalhamento do homogeneizador a uma taxa de cisalhamento de 63, 209 por segundo por 20 minutos com a câmera CCD ligada. Após o experimento, remova a câmara e lave-a com água deionizada.
Observou-se que a intensidade de fluorescência do DNA i-motif aumentou com a taxa de puro variando de 9, 724 por segundo a 97, 245 por segundo em um tampão MES de pH 5,5. No entanto, a intensidade da fluorescência não foi aumentada quando o mesmo DNA i-motif foi cortado a uma taxa de 63, 209 por segundo, pois não se dobra em pH 7,4 no tampão MES. A ligação do ligante às moléculas de i-motivo de DNA submetidas ao fluxo puro foi avaliada, o que mostrou que o incremento da intensidade de fluorescência tornou-se menos óbvio com o aumento da concentração de ligantes.
A constante de dissociação foi determinada para a interação entre o ligante e o motivo i, sendo 34 micromoles. O i-motivo quelado de cobre foi desdobrado na taxa de cisalhamento de 63, 209 por segundo, e o de cobre liberado desencadeou a reação de clique fluorgênico, resultando em aumento da intensidade de fluorescência ao longo do tempo. Em primeiro lugar, certifique-se de que a área de detecção esteja definida entre o rotor e o stater.
Em segundo lugar, verifique e minimize o fundo de fluorescência. E, por último, certifique-se de filtrar a reação antes de executar a reação de clique. Este método abre uma porta de entrada para explorar a resistência mecânica, dobrar e desdobrar todos os tipos de polímeros.
Podem ser outras estruturas de DNA, proteínas ou outros polímeros, e sua interação com outros tipos de moléculas. Como dito, várias outras macromoléculas poderiam ser estudadas usando essa abordagem.
