Questo protocollo fornisce una tecnica ad alto rendimento per studiare il legame intermolecolare tra DNA e ligandi. Questa tecnica ha dimostrato un elevato rendimento nello studio di un massiccio insieme di strutture biomolecolari. Lo fa convertendo le proprietà chimiche meccaniche delle singole molecole in quelle degli insiemi molecolari.
Penso che sia un esperimento molto avanti, ma ci sono pochi passi critici. Ad esempio, l'allineamento del microscopio, dell'omogeneizzatore e del tubo di reazione. Queste tre cose dovrebbero essere perfettamente allineate per tracciare con precisione il cambiamento di fluorescenza.
Inizia assemblando l'omogeneizzatore e il microscopio su un tavolo di montaggio. Dopo aver indossato gli occhiali, accendere il microscopio a fluorescenza e quindi regolare l'omogeneizzatore per assicurarsi che il fascio di luce di eccitazione passi attraverso il centro della punta disperdente dell'omogeneizzatore. Quindi preparare una camera di reazione a fondo piatto di cinque centimetri di altezza e 1,5 per 1,5 centimetri quadrati di sezione trasversale, assicurandosi che il materiale della camera selezionato non fluoresca per ridurre lo sfondo.
Successivamente, bloccare la camera di reazione sullo stadio del campione del microscopio a fluorescenza e quindi regolare la camera per contenere la punta disperdente dell'omogeneizzatore, assicurandosi che la punta sia leggermente al di sopra della superficie inferiore della camera di reazione. Quindi, regolare la posizione verticale dell'omogeneizzatore e della camera insieme per garantire che la messa a fuoco del microscopio sia sulla superficie della punta di dispersione. Quindi regolare la posizione orizzontale della punta di dispersione per assicurarsi che l'area di rilevamento sia impostata tra il rotore e lo stater.
Accendere i canali fluorescenti, secondo il colorante fluorescente utilizzato nell'esperimento. Prima dell'esperimento di taglio ad alta velocità, utilizzare acqua deionizzata per testare la cesoiatura con una bassa velocità di taglio. In primo luogo, preparare un DNA telomerico umano i-motif etichettato con un colorante e un quencher alle sue due estremità rispettivamente in acqua deionizzata come descritto nel manoscritto.
Quindi, diluire il DNA a cinque micromolari in tampone MES da 30 millimolari a pH 5,5 o pH 7,4. Alla soluzione di DNA, aggiungere il ligando L2H24OTD"in un intervallo di concentrazione da zero a 60 micromolari e mescolare delicatamente la soluzione per 10 minuti per piegare le strutture i-motif senza luce. Controllare e ridurre al minimo l'intensità della fluorescenza di fondo della camera di reazione che viene riempita con acqua deionizzata utilizzando il microscopio fluorescente senza cesoiatura.
Quindi impostare i parametri della telecamera CCD utilizzando il software con tempo di esposizione pari a 0,5 secondi, sensibilità CCD di 1.600 e tempo di registrazione pari a 20 minuti. Utilizzando una pipetta lunga, aggiungere la soluzione di DNA nella camera di reazione vuota e pulita e coprire la camera di reazione con una scatola nera. Quindi avviare l'omogeneizzatore per eseguire il taglio a una velocità di taglio selezionata che va da 9.724 al secondo a 97, 245 al secondo per 20 minuti, con la telecamera CCD accesa per registrare i dati.
Dopo l'esperimento, rimuovere la camera e lavarla con acqua deionizzata. Preparare il DNA i-motif e l'acqua deionizzata. Quindi, incubare 10 micromolari i-motif DNA e 300 microlitri di 30 millimolari tris tampone integrato con 150 micromolari cloruro rameico e 300 micromolari acido ascorbico per 10 minuti per piegare le strutture i-motif.
Successivamente ultrafiltrare la soluzione con un dispositivo di ultrafiltrazione ad una forza centrifuga di 14, 300 volte G.Reintegrare la soluzione a circa 500 microlitri con 30 tamponi tris millimolari integrati con acido ascorbico micromolare 300 dopo ogni filtrazione. Dopo aver raccolto la soluzione residua, fare un volume finale di 300 microlitri aggiungendo 30 tris millimolari integrati con acido ascorbico 300 micromolare insieme a 20 micromolari CalFluor 488 Azide, 20 micromolari HPG e 10 micromolari TBTA. Una volta aggiunti i reagenti, spostare la soluzione nella camera oscura.
Quindi controllare e ridurre al minimo l'intensità della fluorescenza di fondo della camera di reazione riempita con acqua deionizzata usando il microscopio prima degli esperimenti di taglio. Quindi, aggiungere la soluzione di DNA nella camera di reazione vuota con una pipetta lunga, quindi avviare la cesoiatura dell'omogeneizzatore a una velocità di taglio di 63, 209 al secondo per 20 minuti con la telecamera CCD accesa. Dopo l'esperimento, rimuovere la camera e lavarla con acqua deionizzata.
È stato osservato che l'intensità di fluorescenza del DNA i-motif aumenta con una velocità che va da 9.724 al secondo a 97.245 al secondo in un tampone MES a pH 5,5. Tuttavia, l'intensità della fluorescenza non è aumentata quando lo stesso DNA i-motif è stato tagliato ad una velocità di 63.209 al secondo, poiché non si piega a pH 7,4 nel tampone MES. È stato valutato il legame del ligando alle molecole di DNA i-motif sottoposte al flusso puro, il che ha dimostrato che l'incremento dell'intensità della fluorescenza è diventato meno evidente con l'aumentare della concentrazione del ligando.
La costante di dissociazione è stata determinata per l'interazione tra il ligando e l'i-motif ed è risultata essere 34 micromoli. Il motivo i-motif chelato in rame è stato spiegato alla velocità di taglio di 63.209 al secondo e quello di rame rilasciato ha innescato la reazione di clic fluorgenico, con conseguente aumento dell'intensità della fluorescenza nel tempo. In primo luogo, assicurarsi che l'area di rilevamento sia impostata tra il rotore e lo stater.
In secondo luogo, controllare e ridurre al minimo lo sfondo di fluorescenza. Infine, assicurati di filtrare la reazione prima di eseguire la reazione al clic. Questo metodo apre una porta per esplorare la resistenza meccanica, piegando e dispiegando tutti i tipi di polimeri.
Potrebbe trattarsi di altre strutture del DNA, proteine o altri polimeri e della loro interazione con altri tipi di molecole. Come detto, diverse altre macromolecole potrebbero essere studiate usando questo approccio.
