从血浆和实体组织中分离和分析可追溯和功能化的细胞外囊泡

该协议提供了一种可行的方法来从大多数血液和实体组织中分离和收集正确的细胞外囊泡，特别是分析其来源和蛋白质含量，这有助于进一步的功能实验。除了高产量和低污染外，该协议的主要优点是分析EV的表面抗原和蛋白质货物，这对于生理和病理学研究很有用。它通过使用流式细胞仪检测细胞外囊泡亲本细胞的表面标志物，促进疾病癌症的诊断，例如炎症性疾病和骨质疏松症。

组织细胞外囊泡的数量对于以下实验至关重要。确保细胞外囊泡的浓度不高。耐心等待稀释。

首先，通过用眼科镊子和剪刀分离上颌骨来制备上颌骨样本，并用PBS清洗它们以用镊子去除软组织。然后将上颌骨放入1.5毫升离心管中，用剪刀将骨头切成直径一毫米的小块。加入一定量的解放酶覆盖组织，在37摄氏度下孵育30分钟。

接下来，在4摄氏度下以800 G离心样品10分钟，并用移液管小心地将上清液转移到新的清洁的1.5毫升离心管中。将制备的血浆和骨样品在2， 500 G和4摄氏度下离心15分钟以除去大细胞碎片和剩余的血小板后，小心地将上清液转移到新的和干净的1.5毫升离心管中，并在4摄氏度下以16， 800 G离心30分钟。接下来，弃去上清液，并用一毫升PBS重悬在每个管中。

如前所述离心并丢弃上清液后，再次用50微升PBS将沉淀重悬于每个管中，并将这些样品在4摄氏度下储存少于24小时或最好立即使用它们进行分析。用500微升PBS重悬样品，并将50微升转移到新的干净的1.5毫升离心管中，作为标记为管A的空白对照，将另外50微升转移到另一个干净的1.5毫升离心管中作为FITC的简单染色管，标记为管B.向原管中加入0.5微升膜染料进行膜染色，同时在室温下孵育五分钟。将原管以16，800G离心30分钟并弃去上清液后，用200微升PBS重悬沉淀。

将每个 50 μL 样品分成四个 1.5 毫升离心管，用于标记为管 C 的 PE 的简单染色管、标记为管 D 的表面标志物染色和标记为试管 E 的仅二抗对照.将破骨细胞相关受体和骨细胞外囊泡样品的一抗以及 CD-18 抗体和血浆细胞外囊泡样品分别添加到试管 B 和试管 D 中， 在四摄氏度下孵育一小时。如前所述离心管并丢弃上清液，并用500微升PBS重悬沉淀。同样，在16，800 G和4摄氏度下离心30分钟以除去额外的一抗。

丢弃上清液后，用50微升PBS重悬沉淀，然后分别在管E中加入FITC偶联的二抗.将所有管在黑暗中以4摄氏度孵育一小时。将一滴0.2、0.5和1微米大小的珠悬浮液分别稀释到一毫升PBS中。然后运行每种尺寸的磁珠以确保为细胞外囊泡选择的门，并设置流式细胞仪的阈值，以使用合适的前向内散射搜索磁珠和细胞外囊泡群。

将终端条件设置为计算 100， 000 个膜染色颗粒，并按照手稿中所述通过流式细胞仪分析样品。将沉淀重悬于50微升RIPA裂解缓冲液中，并在冰上孵育30分钟。为了通过BCA蛋白质测定定量96孔微孔板中所有样品的蛋白质浓度，将每毫升2毫克BSA与0.9%的生理盐水稀释成0.5毫克/毫升。

以每毫升0.5毫克BSA和0.9%的生理盐水进入三个具有一定体积的重复孔中。然后滴下两微升样品，并将18微升生理盐水分别加入三个重复的孔中。通过将BCA试剂A与试剂B混合制备工作溶液后，向每个孔中加入200微升工作溶液并轻轻摇动30秒。

然后将96孔微孔板在37摄氏度下孵育20至25分钟，并用分光光度计测量596纳米处的光密度。接下来，导出数据，绘制标准曲线，并计算样品的蛋白质浓度。根据结果，用0.9%的生理盐水和五倍的SDS-PAGE上样缓冲液将样品稀释至每微升1微克，并用薄膜密封试管并在100摄氏度下加热五分钟。

将蛋白质分子量标准中的样品加载到4至20%HEPy的tris凝胶的梯度浓度中。在电泳缓冲液中以80伏电泳凝胶，直到蛋白质形成一条线。然后切换到 120 伏 1 小时，直到上样染料位于凝胶底部。

使用湿转印系统将凝胶转移到在甲醇中预孵育20秒的聚偏氟乙烯膜上，以200毫安的电流转移一小时。通过将 2.5 克 BSA 和 50 毫升 TBST 加入 50 毫升离心管中来制备 5% BSA 封闭缓冲液。在室温下搅拌将该缓冲液中的膜封闭两小时。

用TBST稀释的特异性一抗孵育膜，使其在4摄氏度下达到适当的浓度过夜。在洗涤缓冲液中洗涤膜四次，并在室温下搅拌将膜与合适的二抗孵育一小时。在洗涤缓冲液中洗涤膜四次后，在凝胶成像系统中使用化学发光试剂盒对膜进行成像。

透射电镜和纳米颗粒跟踪分析表明，细胞外囊泡的典型形态特征为圆形和杯形，直径范围为500-300纳米。流式细胞术分析显示细胞外囊泡上表达的特定膜标志物的百分比，这意味着它们来自亲本细胞。蛋白质印迹分析显示PGD和PKM2的表达分别代表蛋白质含量和血浆细胞外囊泡和骨细胞外囊泡，表明代谢状态。

在细胞外囊泡中检测到Golgin-84的阴性表达，存在丝裂蛋白，α-肌动蛋白-4，氟氏蛋白-1，Caveolin-1和β-肌动蛋白以及囊泡标志物CD9，而CD81表达低或不存在，血浆细胞外囊泡中缺乏APO-A-1。研究人员，所以请记住，步骤2.2，组织样品的制备和消化应充分完成。否则，从组织中提取的细胞外囊泡的数量是有限的。

标记的细胞外囊泡荧光染色剂可以注射到口腔中以治疗与潜在功能相关的阶段。