이 프로토콜은 대부분의 혈액 및 고형 조직에서 올바른 세포외 소포체를 분리 및 수집하고, 특히 소스와 단백질 함량을 분석하여 추가 기능 실험에 도움이 되는 실행 가능한 방법을 제공합니다. 높은 수율과 낮은 오염 외에도 이 프로토콜의 주요 장점은 생리학적 및 병리학적 연구에 유용한 EV의 표면 항원 및 단백질 화물 분석입니다. 그것은 유세포 분석기로 세포 외 소포의 부모 세포의 표면 마커의 검출을 통해 염증성 질환 및 골다공증과 같은 질병의 암 진단을 용이하게합니다.
조직 세포외 소포체의 양은 다음 실험에 중요합니다. 세포 외 소포의 농도가 높지 않은지 확인하십시오. 희석을 수행하기 위해 인내심을 가지십시오.
시작하려면 안과용 핀셋과 가위로 상악골을 분리하여 상악골 샘플을 준비하고 PBS로 세척하여 핀셋으로 연조직을 제거합니다. 그런 다음 상악골을 1.5 밀리리터 원심 분리기 튜브에 넣고 가위로 뼈를 직경 1 밀리미터의 작은 조각으로 자릅니다. 조직을 덮기 위해 일정량의 Libraase를 첨가하고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.
다음으로, 섭씨 4도에서 10분 동안 800G에서 샘플을 원심분리하고 피펫으로 상층액을 새롭고 깨끗한 1.5밀리리터 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 제조된 혈장 및 뼈 샘플을 2, 500 G 및 섭씨 4도에서 15분 동안 원심분리하여 큰 세포 파편 및 잔류 혈소판을 제거한 후, 상층액을 새롭고 깨끗한 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮기고 섭씨 4도에서 30분 동안 16, 800G에서 원심분리한다. 다음으로, 상층액을 버리고 1 밀리리터의 PBS로 각 튜브의 펠릿을 재현탁합니다.
이전에 입증된 바와 같이 상청액을 원심분리하고 버린 후, 다시 50 마이크로리터의 PBS로 각 튜브에 펠릿을 재현탁하고 이들 샘플을 섭씨 4도에서 24시간 미만 동안 보관하거나 바람직하게는 분석을 위해 즉시 사용하십시오. 500 마이크로리터의 PBS로 샘플을 재현탁하고 50 마이크로리터를 튜브 A로 라벨이 붙은 빈 대조군으로 새롭고 깨끗한 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 옮기고 또 다른 50 마이크로리터를 튜브 B로 라벨이 붙은 FITC용 단순 염색 튜브로 다른 깨끗한 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 옮깁니다.실온에서 5분 동안 배양하면서 멤브레인 염색을 위해 0.5 마이크로리터의 멤브레인 염료를 1차 튜브에 추가합니다. 1차 튜브를 16, 800 G에서 30분 동안 원심분리하고 상층액을 버린 후, 펠릿을 200 마이크로리터의 PBS로 재현탁시켰다.
각 50 마이크로 리터 샘플을 튜브 C로 표시된 PE용 간단한 염색 튜브, 튜브 D로 표시된 표면 마커 염색 및 튜브 E로 표시된 2차 항체 전용 대조군을 위해 4개의 1.5밀리리터 원심분리기 튜브로 나눕니다.파골세포 관련 수용체 및 뼈 세포외 소포 샘플의 1차 항체와 CD-18 항체 및 혈장 세포외 소포 샘플을 튜브 B와 튜브 D에 별도로 추가합니다. 섭씨 4도에서 1 시간 동안 배양합니다. 튜브를 원심분리하고 이전에 시연된 대로 상청액을 버리고 500마이크로리터의 PBS로 펠릿을 재현탁합니다. 다시, 섭씨 4도 및 16, 800 G에서 30분 동안 원심분리하여 여분의 1차 항체를 제거하였다.
상층액을 버린 후 펠렛을 50 마이크로리터의 PBS로 재현탁한 후, FITC 접합된 2차 항체를 튜브 E.Incubate에 각각 첨가하여 모든 튜브를 어둠 속에서 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양한다. 0.2, 0.5 및 1 마이크로미터 크기의 비드 현탁액 한 방울을 각각 PBS 1밀리리터로 희석합니다. 그런 다음 각 크기의 비드를 실행하여 세포외 소포체에 대해 선택된 게이트를 확인하고 적절한 전방 내부 산란을 사용하여 비드 및 세포외 소포 집단을 검색하기 위해 유세포 분석기의 임계값을 설정합니다.
말단 조건을 100, 000 개의 막 염색 입자를 계산하는 것으로 설정하고 원고에 설명 된대로 유세포 분석기를 통해 샘플을 분석합니다. 펠릿을 50마이크로리터의 RIPA 용해 완충액에 재현탁하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다. BCA 단백질 분석에 의해 96 웰 마이크로플레이트에 있는 모든 샘플의 단백질 농도를 정량화하기 위해, BSA의 밀리리터당 2밀리그램을 0.9%의 생리 식염수로 밀리리터당 0.5밀리그램으로 희석한다.
BSA 밀리리터당 0.5밀리그램과 생리 식염수 0.9%를 특정 부피의 3개의 복제된 웰에 넣습니다. 그런 다음 2 마이크로 리터의 샘플을 떨어 뜨리고 18 마이크로 리터의 생리 식염수를 3 개의 복제 된 웰에 별도로 첨가하십시오. BCA 시약 A와 시약 B를 혼합하여 작업 용액을 준비한 후 각 웰에 200 마이크로 리터의 작업 용액을 넣고 30 초 동안 부드럽게 흔들어줍니다.
그런 다음 섭씨 37도에서 20-25분 동안 96웰 마이크로플레이트를 배양하고 분광광도계를 사용하여 596나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다. 다음으로, 데이터를 내보내고, 표준 곡선을 그리고, 샘플의 단백질 농도를 계산합니다. 결과에 따라 시료를 마이크로리터당 1마이크로그램으로 0.9%의 생리식염수와 SDS-PAGE 로딩 완충액 농도의 5배로 희석하고 튜브를 필름으로 단단히 밀봉하고 섭씨 100도에서 5분간 가열한다.
단백질 사다리의 샘플을 4-20%HEPy의 트리스 겔의 구배 농도로 로드합니다. 단백질이 라인을 형성할 때까지 80볼트에서 흐르는 완충액에서 젤을 실행합니다. 그런 다음 로딩 염료가 젤 바닥에 올 때까지 1시간 동안 120볼트로 전환합니다.
메틸 알코올에서 20초 동안 미리 인큐베이션된 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인으로 겔을 옮기고 습식 전사 시스템을 사용하여 200 밀리암페어에서 1시간 동안 전사한다. 5밀리리터 원심분리기 튜브에 2.5g의 BSA와 50밀리리터의 TBST를 추가하여 50% BSA 차단 버퍼를 준비합니다. 이 완충액의 멤브레인을 교반하면서 실온에서 2시간 동안 차단합니다.
섭씨 4도에서 밤새 TBST로 희석된 특정 1차 항체로 멤브레인을 적절한 농도로 배양합니다. 세척 완충액에서 양막을 4회 세척하고, 교반하면서 실온에서 1시간 동안 적합한 2차 항체와 함께 양막을 인큐베이션한다. 세척 완충액에서 멤브레인을 4회 세척한 후, 겔 이미징 시스템에서 화학발광 키트를 사용하여 멤브레인을 이미지화합니다.
투과 전자 현미경 및 나노 입자 추적 분석은 세포 외 소포의 전형적인 형태 학적 특성이 500에서 300 나노 미터 범위의 직경을 갖는 둥글고 컵 모양이라는 것을 밝혀 냈습니다. 유세포 분석은 모세포에서 유래했음을 암시하는 세포외 소포에서 발현된 특정 막 마커의 비율을 보여줍니다. 웨스턴 블랏 분석은 대사 상태를 나타내는 단백질 함량과 혈장 세포밖 소포 및 골 세포밖 소포체의 대표적인 단백질 함량으로 각각 PGD와 PKM2의 발현을 보여준다.
세포외 소포에서 골긴-84의 음성 발현은 소포 마커 CD9와 함께 미토필린, 알파-액티닌-4, 플로틸린-1, 카베올린-1 및 베타-액틴의 존재로 검출된 반면, CD81 발현은 혈장 세포외 소포체에 APO-A-1이 존재하지 않아 낮거나 부재합니다. 연구자들은 단계 2.2에서 조직 샘플의 준비 및 소화가 충분히 이루어져야 한다는 점을 명심한다. 그렇지 않으면 조직에서 추출한 세포 외 소포의 수가 제한됩니다.
세포외 소포체의 표지된 형광 염색 마커는 잠재적인 기능과 관련된 단계를 치료하기 위해 입 내로 주사될 수 있다.
