Этот протокол обеспечивает реальный способ выделения и сбора правильных внеклеточных везикул из большинства крови и твердых тканей, особенно анализа их источника и содержания белка, что помогает в дальнейших функциональных экспериментах. Помимо высокого выхода и низкой контаминации, основным преимуществом этого протокола является анализ поверхностных антигенов и белковых грузов ЭВ, что полезно для физиологических и патологических исследований. Он облегчает диагностику раковых заболеваний, таких как воспалительные заболевания и остеопороз, путем обнаружения поверхностных маркеров родительских клеток внеклеточных везикул с помощью проточного цитометра.
Количество тканевых внеклеточных везикул имеет решающее значение для следующих экспериментов. Убедитесь, что концентрация внеклеточных везикул не высока. Наберитесь терпения, чтобы выполнить разведение.
Для начала подготовьте образцы верхнечелюстной кости, изолировав верхнечелюстную кость офтальмологическим пинцетом и ножницами, и промойте их PBS, чтобы избавиться от мягких тканей пинцетом. Затем поместите верхнечелюстную кость в центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра и разрежьте кость ножницами на небольшие кусочки диаметром один миллиметр. Добавьте определенное количество либеразы, чтобы покрыть ткань, и инкубируйте в течение 30 минут при температуре 37 градусов по Цельсию.
Затем центрифугируйте образец при 800 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и осторожно перенесите надосадочную жидкость с помощью пипетки в новую и чистую центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. После центрифугирования подготовленной плазмы и образцов костей в течение 15 минут при температуре 2 500 г и четырех градусах Цельсия для удаления крупных клеточных остатков и оставшихся тромбоцитов осторожно перенесите надосадочные жидкости в новые и очистите центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра и центрифугу при 16 800 г в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Затем выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы в каждой пробирке с одним миллилитром PBS.
После центрифугирования и отбрасывания надосадочной жидкости, как показано ранее, снова ресуспендируйте гранулы в каждой пробирке с 50 микролитрами PBS и храните эти образцы при четырех градусах Цельсия менее 24 часов или, предпочтительно, немедленно используйте их для анализа. Ресуспендируют образцы с 500 микролитрами PBS и переносят 50 микролитров в новую чистую центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра в качестве заготовки контрольной пробирки, помеченной как пробирка A, и еще 50 микролитров в другую чистую центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра в виде простой пробирки для окрашивания FITC, помеченной как пробирка B. Добавьте 0,5 микролитра мембранного красителя в первичную пробирку для окрашивания мембраны во время инкубации в течение пяти минут при комнатной температуре. После центрифугирования первичной пробирки в течение 30 минут при 16 800 G и отбрасывания надосадочной жидкости ресуспендировать гранулы с 200 микролитрами PBS.
Разделите каждый образец объемом 50 микролитров на четыре центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра для простого окрашивания пробирок для ПЭ, помеченных как пробирка C, окрашивания поверхностных маркеров, помеченных как пробирка D, и вторичных контрольных групп, содержащих только антитела, помеченных как пробирка E. Добавьте первичное антитело рецептора, связанного с остеокластами, и образцы костных внеклеточных везикул, а также образцы антител CD-18 и внеклеточных везикул плазмы в пробирку B и пробирку D отдельно, инкубация в течение одного часа при четырех градусах Цельсия. Центрифугируйте пробирки и откажитесь от надосадочной жидкости, как показано ранее, и ресуспендируйте гранулы с 500 микролитрами PBS. Опять же, центрифуга в течение 30 минут при 16, 800 G и четырех градусах Цельсия, чтобы удалить лишние первичные антитела.
После удаления надосадочной жидкости ресуспендируют гранулы с 50 микролитрами PBS с последующим добавлением конъюгированных вторичных антител FITC соответственно в пробирку E. Инкубируйте все пробирки в течение одного часа при четырех градусах Цельсия в темноте. Разбавьте одну каплю суспензии шариков размером 0,2, 0,5 и один микрометр соответственно в один миллилитр PBS. Затем запустите шарики каждого размера, чтобы убедиться в том, что ворота выбраны для внеклеточных везикул, и установите порог проточного цитометра для поиска шариков и популяции внеклеточных везикул с использованием подходящего прямого внутреннего рассеяния.
Установите конечное состояние как расчет 100 000 окрашенных мембраной частиц и проанализируйте образец с помощью проточного цитометра, как описано в рукописи. Ресуспендировать гранулы в 50 микролитрах буфера RIPA-лизиса и инкубировать в течение 30 минут на льду. Чтобы количественно определить концентрацию белка во всех образцах в 96-луночной микропланшете с помощью анализа белка BCA, разбавьте два миллиграмма на миллилитр BSA 0,9% нормального физиологического раствора до 0,5 миллиграмма на миллилитр.
При 0,5 миллиграмма на миллилитр BSA и 0,9% нормального физиологического раствора в три дублированные лунки с определенными объемами. Затем опустите два микролитра образцов и добавьте 18 микролитров физиологического раствора в три продублированные лунки отдельно. После приготовления рабочего раствора путем смешивания реагента BCA A с реагентом B добавьте в каждую лунку по 200 микролитров рабочего раствора и аккуратно встряхните в течение 30 секунд.
Затем инкубируйте 96-луночную микропластину в течение 20-25 минут при 37 градусах Цельсия и измерьте оптическую плотность на расстоянии 596 нанометров с помощью спектрофотометра. Затем экспортируйте данные, нарисуйте стандартную кривую и рассчитайте концентрацию белка в образцах. Согласно результатам, разбавьте образцы до одного микрограмма на микролитр 0,9% нормального физиологического раствора и в пять раз превышающей концентрацию загрузочного буфера SDS-PAGE, плотно закройте пробирки пленкой и нагрейте в течение пяти минут при 100 градусах Цельсия.
Загрузите образцы в белковую лестницу в градиентную концентрацию от четырех до 20% трис-геля HEPy. Пропустите гель в проточный буфер при напряжении 80 вольт, пока белки не образуют линию. Затем переключитесь на 120 вольт в течение одного часа, пока загрузочный краситель не окажется на дне геля.
Перенесите гель на мембрану из поливинилиденфторида, предварительно инкубированную в метиловом спирте в течение 20 секунд, используя систему влажного переноса, для переноса в течение одного часа при 200 миллиамперах. Приготовьте 5%-ный буфер для блокировки BSA, добавив 2,5 грамма BSA и 50 миллилитров TBST в 50-миллилитровую центрифужную пробирку. Заблокируйте мембраны в этом буфере на два часа при комнатной температуре при перемешивании.
Инкубируйте мембраны со специфическими первичными антителами, разбавленными TBST до надлежащей концентрации в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Промойте мембраны в моющем буфере четыре раза и инкубируйте мембраны с подходящими вторичными антителами в течение одного часа при комнатной температуре с перемешиванием. После четырехкратной промывки мембран в буфере для промывки нанесите изображение мембран с помощью набора хемилюминесценции в гелевой системе визуализации.
Просвечивающая электронная микроскопия и анализ отслеживания наночастиц показали, что типичные морфологические характеристики внеклеточных везикул были круглыми и чашеобразными диаметром от 500 до 300 нанометров. Анализ проточной цитометрии показывает процентное содержание специфических мембранных маркеров, экспрессируемых на внеклеточных везикулах, что свидетельствует об их происхождении от родительских клеток. Вестерн-блоттинг показывает экспрессию ПГД и ПКМ2 соответственно как представителя содержания белка и внеклеточных везикул плазмы и костных внеклеточных везикул, что указывает на метаболический статус.
Отрицательная экспрессия Golgin-84 во внеклеточных везикулах была обнаружена с присутствием митофилина, альфа-актинина-4, флотиллина-1, кавеолина-1 и бета-актина, а также маркера везикул CD9, в то время как экспрессия CD81 низкая или отсутствует при отсутствии APO-A-1 во внеклеточных везикулах плазмы. Исследователи, поэтому, имея в виду, что на этапе 2.2, подготовка и переваривание образцов тканей должны быть выполнены в достаточной степени. В противном случае количество внеклеточных везикул, извлеченных из тканей, ограничено.
Маркер, меченный флуоресцентным окрашиванием внеклеточных везикул, может быть введен в рот для лечения фазы, связанной с потенциальной функцией.
