Este protocolo fornece uma maneira viável de isolar e coletar as vesículas extracelulares corretas da maioria dos tecidos sanguíneos e sólidos, especialmente analisar sua fonte e o conteúdo de proteínas, o que ajuda em experimentos funcionais posteriores. Além do alto rendimento e da baixa contaminação, a principal vantagem deste protocolo é a análise de antígenos de superfície e cargas proteicas de EVs, o que é útil para estudos fisiológicos e patológicos. Facilita o diagnóstico de cânceres de doenças, como doenças inflamatórias e osteoporose através da detecção de marcadores de superfície de células parentais de vesículas extracelulares com citômetro de fluxo.
A quantidade de vesícula extracelular tecidual é crítica para os experimentos seguintes. Certifique-se de que a concentração de vesícula extracelular não é alta. Tenha paciência para realizar a diluição.
Para começar, prepare as amostras de osso maxilar isolando o osso maxilar com pinça oftálmica e tesoura e lave-as com PBS para se livrar dos tecidos moles com pinça. Em seguida, coloque o osso maxilar em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro e corte o osso em pequenos pedaços de um milímetro de diâmetro com tesoura. Adicione uma certa quantidade de Liberase para cobrir o tecido e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius.
Em seguida, centrifugar a amostra a 800 G por 10 minutos a quatro graus Celsius e transferir cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta para um tubo de centrífuga novo e limpo de 1,5 mililitro. Depois de centrifugar as amostras de plasma e osso preparadas por 15 minutos a 2, 500 G e quatro graus Celsius para remover grandes restos celulares e plaquetas remanescentes, transfira cuidadosamente os sobrenadantes para tubos de centrífuga novos e limpos de 1,5 mililitro e centrífuga a 16.800 G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda os pellets em cada tubo com um mililitro de PBS.
Após centrifugar e descartar o sobrenadante como demonstrado anteriormente, ressuspenda os pellets em cada tubo com 50 microlitros de PBS e armazene essas amostras a quatro graus Celsius por menos de 24 horas ou, de preferência, use-as imediatamente para as análises. Ressuspenda amostras com 500 microlitros de PBS e transfira 50 microlitros para um novo e limpo tubo centrífugo de 1,5 mililitro como um controle em branco rotulado como tubo A e outros 50 microlitros para outro tubo de centrífuga limpo de 1,5 mililitro como um tubo de coloração simples para FITC, rotulado como tubo B.Adicione 0,5 microlitros de corante de membrana ao tubo primário para coloração de membrana enquanto incuba por cinco minutos à temperatura ambiente. Após centrifugar o tubo primário por 30 minutos a 16,800 G e descartar o sobrenadante, ressuspender os pellets com 200 microlitros de PBS.
Divida cada amostra de 50 microlitros em quatro tubos de centrífuga de 1,5 mililitro para tubos de coloração simples para PE marcados como tubo C, coloração de marcador de superfície marcada como tubo D e controles secundários somente de anticorpos rotulados como tubo E.Adicione o anticorpo primário do receptor associado aos osteoclastos e amostras de vesícula extracelular óssea, bem como amostras de anticorpos CD-18 e vesículas extracelulares plasmáticas ao tubo B e ao tubo D separadamente, incubando por uma hora a quatro graus Celsius. Centrifugar os tubos e descartar o sobrenadante conforme demonstrado anteriormente e ressuspender os pellets com 500 microlitros de PBS. Novamente, centrifugar por 30 minutos a 16, 800 G e quatro graus Celsius para remover os anticorpos primários extras.
Após o descarte do sobrenadante, ressuspenda os pellets com 50 microlitros de PBS, seguido da adição de anticorpos secundários conjugados FITC, respectivamente, no tubo E.Incube todos os tubos por uma hora a quatro graus Celsius no escuro. Diluir uma gota de 0,2, 0,5 e uma suspensão de contas de tamanho micrométrico, respectivamente, em um mililitro de PBS. Em seguida, execute cada tamanho de contas para certificar-se da porta escolhida para vesículas extracelulares e defina o limiar do citômetro de fluxo para procurar a população de contas e vesículas extracelulares usando uma dispersão interna adequada para frente.
Defina a condição terminal como calculando 100.000 partículas tingidas por membrana e analise a amostra por meio de um citômetro de fluxo, conforme descrito no manuscrito. Ressuspender os pellets em 50 microlitros de tampão de lise RIPA e incubar por 30 minutos sobre gelo. Para quantificar as concentrações de proteína de todas as amostras na microplaca de 96 poços pelo ensaio de proteína BCA, diluir os dois miligramas por mililitros de BSA com 0,9% de solução salina normal em 0,5 miligramas por mililitros.
A 0,5 miligramas por mililitro de BSA e 0,9% de soro fisiológico normal em três poços duplicados com certos volumes. Em seguida, solte dois microlitros das amostras e adicione 18 microlitros de soro fisiológico normal em três poços duplicados separadamente. Depois de preparar uma solução de trabalho misturando o reagente A de BCA com o reagente B, adicione 200 microlitros da solução de trabalho a cada poço e agite suavemente durante 30 segundos.
Em seguida, incube a microplaca de 96 poços por 20 a 25 minutos a 37 graus Celsius e meça a densidade óptica em 596 nanômetros com o espectrofotômetro. Em seguida, exporte os dados, desenhe uma curva padrão e calcule a concentração de proteína das amostras. De acordo com os resultados, diluir as amostras para um micrograma por microlitro com 0,9% de soro fisiológico normal e cinco vezes a concentração do tampão de carregamento SDS-PAGE e selar os tubos com filme firmemente e aquecer por cinco minutos a 100 graus Celsius.
Coloque as amostras na escada de proteína em um gradiente de concentração de quatro a 20% de gel tris de HEPy. Passe o gel no tampão de corrida a 80 volts até que as proteínas formem uma linha. Em seguida, mude para 120 volts por uma hora até que o corante de carga esteja na parte inferior do gel.
Transferir o gel para a membrana de fluoreto de polivinilideno pré-incubada em álcool metílico por 20 segundos usando um sistema de transferência úmida para transferir por uma hora a 200 miliamperes. Prepare o tampão de bloqueio de BSA a 5% adicionando 2,5 gramas de BSA e 50 mililitros de TBST em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Bloquear as membranas neste tampão durante duas horas à temperatura ambiente com agitação.
Incubar as membranas com anticorpos primários específicos diluídos com TBST em concentração adequada durante a noite a quatro graus Celsius. Lavar as membranas no tampão de lavagem quatro vezes e incubar as membranas com anticorpos secundários adequados durante uma hora à temperatura ambiente com agitação. Depois de lavar as membranas no tampão de lavagem quatro vezes, obtenha imagens das membranas usando o kit de quimioluminescência em um sistema de imagem em gel.
A microscopia eletrônica de transmissão e a análise de rastreamento de nanopartículas revelaram que as características morfológicas típicas das vesículas extracelulares foram redondas e em forma de taça com um diâmetro variando de 500 a 300 nanômetros. A análise por citometria de fluxo mostra as porcentagens de marcadores de membrana específicos expressos em vesículas extracelulares que implicam sua origem a partir de células parentais. A análise de Western blot mostra a expressão de PGD e PKM2, respectivamente, como representante do conteúdo proteico e das vesículas extracelulares plasmáticas e extracelulares ósseas, indicando o estado metabólico.
A expressão negativa de Golgin-84 em vesículas extracelulares foi detectada com a presença de mitofilina, alfa-actinina-4, flotillina-1, caveolina-1 e beta-actina, juntamente com o marcador de vesículas CD9, enquanto a expressão de CD81 é baixa ou ausente com a ausência de existência de APO-A-1 nas vesículas extracelulares plasmáticas. Pesquisadores, portanto, tendo em mente que a etapa 2.2, a preparação e a digestão das amostras de tecido devem ser feitas suficientemente. Caso contrário, o número de vesículas extracelulares extraídas dos tecidos é limitado.
O marcador marcado coloração fluorescente das vesículas extracelulares pode ser injetado na boca para tratar a fase que está ligada à função potencial.
