このプロトコルは、ほとんどの血液および固体組織から適切な細胞外小胞を単離および収集し、特にそれらの供給源およびタンパク質含有量を分析するための実行可能な方法を提供し、さらなる機能実験に役立ちます。高収率と低汚染に加えて、このプロトコルの主な利点は、生理学的および病理学的研究に役立つEVの表面抗原とタンパク質貨物の分析です。フローサイトメーターで細胞外小胞の親細胞の表面マーカーを検出することにより、炎症性疾患や骨粗鬆症などの疾患の癌の診断を容易にします。
組織細胞外小胞の量は、以下の実験にとって重要である。細胞外小胞の濃度が高くないことを確認してください。希釈を実行するのを我慢してください。
まず、眼科用ピンセットとはさみで上顎骨を分離して上顎骨サンプルを準備し、PBSで洗浄してピンセットで軟組織を取り除きます。次に、上顎骨を1.5ミリリットルの遠沈管に入れ、ハサミで骨を直径1ミリメートルの小片に切ります。組織を覆うために一定量のリベラーゼを加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。
次に、サンプルを800 Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、ピペットで上清を新しく清潔な1.5ミリリットルの遠沈管に注意深く移します。調製した血漿および骨サンプルを2, 500 Gおよび摂氏4度で15分間遠心分離して大きな細胞破片および残りの血小板を除去した後、上清を新しく清潔な1.5ミリリットルの遠心分離管に慎重に移し、16, 800Gで摂氏4度で30分間遠心分離する。次に、上清を捨て、ペレットを各チューブに1ミリリットルのPBSで再懸濁します。
前述のように上清を遠心分離して廃棄した後、再び、ペレットを各チューブに50マイクロリットルのPBSで再懸濁し、これらのサンプルを摂氏4度で24時間未満保存するか、できればすぐに分析に使用します。サンプルを500マイクロリットルのPBSで再懸濁し、50マイクロリットルをチューブAとラベル付けされたブランクコントロールとして新しい清潔な1.5ミリリットルの遠心分離管に移し、さらに50マイクロリットルを別のきれいな1.5ミリリットル遠心管に移しますFITC用の単純な染色チューブとして、チューブBとしてラベル付けされています室温で5分間インキュベートしながら、膜染色のために0.5マイクロリットルの膜色素を一次チューブに追加します。一次チューブを16, 800Gで30分間遠心分離し、上清を捨てた後、ペレットを200マイクロリットルのPBSで再懸濁します。
各50マイクロリットルのサンプルを4つの1.5ミリリットル遠沈管に分割し、チューブCとしてラベル付けされたPE、チューブDとラベル付けされた表面マーカー染色、およびチューブEとしてラベル付けされた二次抗体のみのコントロール用の単純な染色チューブに、破骨細胞関連受容体および骨細胞外小胞サンプルの一次抗体、ならびにCD-18抗体および血漿細胞外小胞サンプルをチューブBおよびチューブDに別々に追加します。 摂氏4度で1時間インキュベートする。チューブを遠心分離し、前述のように上清を廃棄し、ペレットを500マイクロリットルのPBSで再懸濁します。再度、16, 800 Gおよび摂氏4度で30分間遠心分離し、余分な一次抗体を除去した。
上清を捨てた後、ペレットを50マイクロリットルのPBSで再懸濁し、続いてチューブE.EにFITC結合二次抗体をそれぞれ加え、暗所で摂氏4度で1時間すべてのチューブをインキュベートする。0.2、0.5、および1マイクロメートルサイズのビーズ懸濁液をそれぞれ1滴ずつ1ミリリットルのPBSに希釈します。次に、ビーズの各サイズを実行して、細胞外小胞用に選択されたゲートを確認し、フローサイトメーターのしきい値を設定して、適切な前方内部散乱を使用してビーズと細胞外小胞集団を検索します。
100, 000個の膜染色粒子を計算するように最終条件を設定し、原稿に記載されているようにフローサイトメーターを介してサンプルを分析します。ペレットを50マイクロリットルのRIPA溶解バッファーに再懸濁し、氷上で30分間インキュベートします。BCAタンパク質アッセイによって96ウェルマイクロプレート内のすべてのサンプルのタンパク質濃度を定量するには、BSA1ミリリットルあたり2ミリグラムを0.9%の生理食塩水で0.5ミリグラム/ミリリットルに希釈します。
BSA1ミリリットル当たり0.5ミリグラムおよび0.9%の生理食塩水を、特定の容量の3つの複製ウェルに入れる。次に、2マイクロリットルのサンプルをドロップし、18マイクロリットルの生理食塩水を3つの複製ウェルに別々に追加します。BCA試薬Aと試薬Bを混合して作業溶液を調製した後、各ウェルに200マイクロリットルの作業溶液を加え、30秒間穏やかに振とうします。
次に、96穴マイクロプレートを摂氏37度で20〜25分間インキュベートし、分光光度計で596ナノメートルの光学密度を測定します。次に、データをエクスポートし、検量線を描き、サンプルのタンパク質濃度を計算します。結果によると、サンプルを0.9%の生理食塩水と5倍の濃度のSDS-PAGEローディングバッファーで1マイクロリットルあたり1マイクログラムに希釈し、チューブをフィルムでしっかりと密封し、摂氏100度で5分間加熱します。
タンパク質ラダー内のサンプルを、4〜20%HEPyのトリスゲルの勾配濃度にロードします。タンパク質がラインを形成するまで、ランニングバッファーでゲルを80ボルトで流します。次に、ローディング染料がゲルの底に来るまで120ボルトに1時間切り替えます。
ゲルをポリフッ化ビニリデン膜に移し、湿式転写システムを用いてメチルアルコール中で20秒間プレインキュベートし、200ミリアンペアで1時間移送する。2.5グラムのBSAと50ミリリットルのTBSTを50ミリリットルの遠沈管に加えることにより、5%BSAブロッキングバッファーを調製します。このバッファー中のメンブレンを室温で2時間撹拌しながらブロックします。
TBSTで希釈した特異的一次抗体でメンブレンを適切な濃度に4°Cで一晩インキュベートします。洗浄バッファーでメンブレンを4回洗浄し、メンブレンを適切な二次抗体とともに室温で1時間撹拌しながらインキュベートします。洗浄バッファーでメンブレンを4回洗浄した後、ゲルイメージングシステムで化学発光キットを使用してメンブレンをイメージングします。
透過型電子顕微鏡とナノ粒子追跡分析により、細胞外小胞の典型的な形態学的特徴は、直径500〜300ナノメートルの円形でカップ状であることが明らかになりました。フローサイトメトリー分析は、細胞外小胞に発現する特定のメンブレンマーカーの割合を示し、親細胞からの起源を示唆しています。ウェスタンブロット解析は、タンパク質含量ならびに血漿細胞外小胞および骨細胞外小胞の代表としてそれぞれPGDおよびPKM2の発現を示し、代謝状態を示す。
細胞外小胞におけるゴルギン-84の陰性発現は、ミトフィリン、α-アクチニン-4、フロチリン-1、カベオリン-1、およびβ-アクチンの存在、および小胞マーカーCD9の存在で検出されましたが、CD81の発現は低いか、血漿細胞外小胞にAPO-A-1が存在しない。研究者は、ステップ2.2、組織サンプルの調製および消化が十分に行われるべきであることを念頭に置いている。そうでなければ、組織から抽出される細胞外小胞の数は制限される。
細胞外小胞のマーカー標識蛍光染色剤を口に注入して、潜在的な機能に関連する相を治療することができます。
