يوفر هذا البروتوكول طريقة مجدية لعزل وجمع الحويصلات الصحيحة خارج الخلية من معظم الدم والأنسجة الصلبة ، وخاصة تحليل مصدرها ومحتويات البروتين ، مما يساعد على إجراء المزيد من التجارب الوظيفية. إلى جانب الغلة العالية والتلوث المنخفض ، فإن الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي تحليل المستضدات السطحية وشحنات البروتين من المركبات الكهربائية وهو أمر مفيد للدراسات الفسيولوجية والمرضية. يسهل تشخيص سرطانات الأمراض ، مثل الأمراض الالتهابية وهشاشة العظام من خلال الكشف عن العلامات السطحية للخلايا الأبوية للحويصلات خارج الخلية باستخدام مقياس التدفق الخلوي.
كمية الحويصلة خارج الخلية من الأنسجة أمر بالغ الأهمية للتجارب التالية. تأكد من أن تركيز الحويصلة خارج الخلية ليس مرتفعا. التحلي بالصبر لأداء التخفيف.
للبدء ، قم بإعداد عينات عظم الفك العلوي عن طريق عزل عظم الفك العلوي بملاقط ومقص العيون وغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني للتخلص من الأنسجة الرخوة بالملاقط. ثم ضع عظم الفك العلوي في أنابيب طرد مركزي 1.5 ملليلتر وقطع العظم إلى قطع صغيرة قطرها ملليمتر واحد بالمقص. أضف كمية معينة من Liberase لتغطية الأنسجة واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
بعد ذلك ، قم بطرد العينة عند 800 جرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ونقل المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة إلى أنابيب طرد مركزي جديدة ونظيفة سعة 1.5 ملليلتر. بعد الطرد المركزي لعينات البلازما والعظام المحضرة لمدة 15 دقيقة عند 2،500 جم وأربع درجات مئوية لإزالة حطام الخلايا الكبيرة والصفائح الدموية المتبقية ، قم بنقل المواد الطافية بعناية إلى أنابيب طرد مركزي جديدة ونظيفة سعة 1.5 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 16،800 جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الكريات في كل أنبوب بمليلتر واحد من PBS.
بعد الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية كما هو موضح سابقا ، مرة أخرى ، أعد تعليق الكريات في كل أنبوب ب 50 ميكرولترا من PBS وقم بتخزين هذه العينات عند أربع درجات مئوية لمدة تقل عن 24 ساعة أو يفضل استخدامها على الفور للتحليلات. أعد تعليق العينات ب 500 ميكرولتر من PBS وانقل 50 ميكرولترا إلى أنبوب طرد مركزي جديد ونظيف سعة 1.5 ملليلتر كعنصر تحكم فارغ يسمى الأنبوب A و 50 ميكرولترا آخر في أنبوب طرد مركزي نظيف آخر سعة 1.5 ملليلتر كأنبوب تلطيخ بسيط ل FITC ، المسمى الأنبوب B.أضف 0.5 ميكرولتر من صبغة الغشاء إلى الأنبوب الأساسي لتلطيخ الغشاء أثناء الحضانة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي للأنبوب الأساسي لمدة 30 دقيقة عند 16،800 جم والتخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الكريات ب 200 ميكرولتر من PBS.
قسم كل عينة سعة 50 ميكرولترا إلى أربعة أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر لأنابيب تلطيخ بسيطة ل PE المسمى بالأنبوب C ، وتلطيخ علامات السطح المسمى بالأنبوب D ، وعناصر التحكم الثانوية للأجسام المضادة فقط المسماة بالأنبوب E.أضف الجسم المضاد الأساسي لمستقبلات ناقضة العظم المرتبطة وعينات الحويصلة العظمية خارج الخلية بالإضافة إلى عينات الأجسام المضادة CD-18 وحويصلة البلازما خارج الخلية إلى الأنبوب B والأنبوب D بشكل منفصل ، الحضانة لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب وتجاهل المادة الطافية كما هو موضح سابقا وإعادة تعليق الكريات مع 500 ميكرولتر من PBS. مرة أخرى ، أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة عند 16 ، 800 G وأربع درجات مئوية لإزالة الأجسام المضادة الأولية الإضافية.
بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الكريات ب 50 ميكرولترا من PBS ، متبوعا بإضافة الأجسام المضادة الثانوية المترافقة FITC على التوالي في الأنبوب E.احتضان جميع الأنابيب لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية في الظلام. تمييع قطرة واحدة من 0.2 ، 0.5 ، وتعليق حبة واحدة بحجم ميكرومتر على التوالي في ملليلتر واحد من PBS. ثم قم بتشغيل كل حجم من الخرز للتأكد من البوابة المختارة للحويصلات خارج الخلية وتعيين عتبة مقياس التدفق الخلوي للبحث عن الخرز وسكان الحويصلات خارج الخلية باستخدام مبعثر داخلي أمامي مناسب.
اضبط الحالة النهائية على حساب 100،000 جسيم مصبوغ بالغشاء وقم بتحليل العينة عبر مقياس التدفق الخلوي كما هو موضح في المخطوطة. أعد تعليق الكريات في 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت RIPA-lysis واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الجليد. لتحديد تركيزات البروتين لجميع العينات في الصفيحة الدقيقة 96 جيدا بواسطة مقايسة بروتين BCA ، قم بتخفيف ملليغرام لكل ملليلتر من BSA مع 0.9٪ من المحلول الملحي العادي إلى 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر.
عند 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر من BSA و 0.9٪ من المياه المالحة العادية في ثلاثة آبار مكررة بأحجام معينة. ثم قم بإسقاط ميكرولتر من العينات وأضف 18 ميكرولترا من المياه المالحة العادية في ثلاثة آبار مكررة بشكل منفصل. بعد تحضير محلول عملي عن طريق خلط كاشف BCA A مع الكاشف B ، أضف 200 ميكرولتر من محلول العمل إلى كل بئر ورجه برفق لمدة 30 ثانية.
ثم احتضان الصفيحة الدقيقة 96 جيدا لمدة 20 إلى 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية وقياس الكثافة البصرية عند 596 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. بعد ذلك ، قم بتصدير البيانات ، وارسم منحنى قياسيا ، واحسب تركيز البروتين للعينات. وفقا للنتائج ، قم بتخفيف العينات إلى ميكروجرام واحد لكل ميكرولتر بنسبة 0.9٪ من محلول ملحي عادي وخمسة أضعاف تركيز مخزن التحميل SDS-PAGE وأغلق الأنابيب بغشاء محكم وسخن لمدة خمس دقائق عند 100 درجة مئوية.
قم بتحميل العينات في سلم البروتين بتركيز متدرج من أربعة إلى 20٪ من جل تريس HEPy. قم بتشغيل الجل في المخزن المؤقت الجاري عند 80 فولت حتى تشكل البروتينات خطا. ثم قم بالتبديل إلى 120 فولت لمدة ساعة واحدة حتى تصبح صبغة التحميل في قاع الجل.
انقل الجل إلى غشاء فلوريد البولي فينيليدين المحتضن مسبقا في كحول الميثيل لمدة 20 ثانية باستخدام نظام نقل رطب لنقله لمدة ساعة واحدة عند 200 مللي أمبير. قم بإعداد مخزن منع 5٪ BSA عن طريق إضافة 2.5 جرام من BSA و 50 ملليلتر من TBST في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر. سد الأغشية في هذا المخزن المؤقت لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة.
احتضان الأغشية بأجسام مضادة أولية محددة مخففة ب TBST إلى تركيز مناسب طوال الليل عند أربع درجات مئوية. اغسل الأغشية في المخزن المؤقت للغسيل أربع مرات واحتضن الأغشية بأجسام مضادة ثانوية مناسبة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة. بعد غسل الأغشية في المخزن المؤقت للغسيل أربع مرات ، قم بتصوير الأغشية باستخدام مجموعة التلألؤ الكيميائي في نظام التصوير الهلامي.
كشف المجهر الإلكتروني النافذ وتحليل تتبع الجسيمات النانوية أن الخصائص المورفولوجية النموذجية للحويصلات خارج الخلية كانت مستديرة وعلى شكل كوب بقطر يتراوح من 500 إلى 300 نانومتر. يظهر تحليل قياس التدفق الخلوي النسب المئوية لعلامات غشائية محددة يتم التعبير عنها على الحويصلات خارج الخلية والتي تشير إلى أصلها من الخلايا الأم. يظهر تحليل اللطخة الغربية تعبير PGD و PKM2 على التوالي كممثل لمحتوى البروتين والحويصلات خارج الخلية في البلازما والحويصلات العظمية خارج الخلية ، مما يشير إلى الحالة الأيضية.
تم الكشف عن التعبير السلبي ل Golgin-84 في الحويصلات خارج الخلية مع وجود ميتوفيلين ، ألفا أكتينين -4 ، أسطول -1 ، كافولين -1 ، وبيتا أكتين ، جنبا إلى جنب مع علامة الحويصلات CD9 ، في حين أن تعبير CD81 منخفض أو غائب مع عدم وجود APO-A-1 في الحويصلات خارج الخلية البلازما. الباحثون ، لذلك مع الأخذ في الاعتبار أن الخطوة 2.2 ، يجب أن يتم إعداد وهضم عينات الأنسجة بشكل كاف. خلاف ذلك ، فإن عدد الحويصلات خارج الخلية المستخرجة من الأنسجة محدود.
يمكن حقن العلامة المسمى بقعة الفلورسنت للحويصلات خارج الخلية في الفم لعلاج المرحلة المرتبطة بالوظيفة المحتملة.
