研究癌症转移至肺部的永久窗口

该协议允许回答癌症转移领域的一个重要问题。包括，肿瘤细胞如何定植于肺部？肿瘤细胞如何保持休眠状态？

以及是什么诱使它们退出休眠并最终形成转移。该协议的主要优点是动态转移过程可以直接在体内实时，在真实的微环境中进行研究。这种方法可以提供对几种肺部疾病的见解，但它对于了解单个肿瘤细胞扩散到肺部的行为特别有用，肺部是转移的常见部位。

首先使用2-0的丝绸缝合线在22号导管的底部打结，留下2英寸长的尾巴。一旦小鼠完全麻醉，将鼠标移动到手术台上，插管小鼠，然后通过将2-0的丝线绑在小鼠的鼻子周围来固定插管导管。将呼吸机连接到插管导管。

使用纸胶带，将前颅骨和后肢尾部固定到加热的手术阶段。沿着小鼠背部的长度放置纸带，以最大限度地暴露在手术区域。用镊子抬起皮肤，在胸骨左侧约7毫米处做一个约10毫米的圆形切口，在肋下边缘上方约7毫米处。

切除肋骨上方的软组织。使用镊子抬高第六和第七肋骨。使用钝性微解剖剪刀的单刃，圆润的一面朝向肺部，小心地刺穿第六肋和第七肋之间的肋间肌肉，以进入胸腔内空间。

在缺陷处精细地排出压缩空气罐，使肺塌陷并将肺与胸壁分开。在短时间内发射压缩空气，以防止医源性肺损伤。将活检冲头放在切削工具上，并通过肋间切口小心地操纵切削工具的底座。

将切削刀座与胸壁平行定向，并在肋骨架上打一个 5 mm 的圆孔。使用5-O丝绸缝合线，将钱包线缝合，距孔约1毫米，圆周。接下来，将窗框定位到胸壁中，并在窗户凹槽内捕获圆形缺陷的边缘。

紧紧绑住5-O丝线，以牢固地锁定植入的窗户。使用稳定温和的压缩空气流约10至20秒，使肺部干燥。使用镊子抓住窗框的外缘，然后轻轻抬起，以确保肺与窗框的下表面分离。

沿着光学窗框的底面分配一层薄薄的氰基丙烯酸酯粘合剂。轻轻但牢固地将光学窗框压在肺组织上10至20秒以进行附着。在矩形盖玻片上滴下 5 mm 的胶粘剂。

使用真空拾取工具拾取 5 mm 盖玻片。将盖板的底面浸入胶粘剂中，然后将多余的胶粘剂刮掉三次，贴在矩形盖玻片的侧面，使盖玻片上形成一层很薄的胶粘剂。小心地将盖玻片以凹槽内一定角度放置，位于光学窗框的中心，正好位于肺组织的上方。

短暂夹住呼吸机以产生正压，使肺部过度充气。将盖玻片平行于肺组织定向，利用旋转运动在肺表面和盖玻片的下表面之间产生直接沉积。保持轻柔的压力约25秒，以设置氰基丙烯酸酯粘合剂。

用镊子将盖玻片与真空拾取工具分开。使用5-O丝线缝合线，从皮肤切口的切割边缘开始，圆周缝合一个钱包线线， 小于1毫米。将任何多余的皮肤塞入窗框外缘下方，然后用锁结将窗户紧紧地绑住。

在金属玻璃界面处分配少量粘合剂，以确保盖玻片和窗框之间的气密密封。将无菌针头连接到1ml胰岛素注射器上。将针插入xiphoid突下方，向左肩推进，通过横膈膜进入胸腔。

轻轻地抽出注射器，以除去胸腔中的任何残余空气。单个肺区域的多光子活体成像显示，微血管可以连续三天重新定位。连续每天确定单个容器的可定义分支点。

未标记的红细胞在较大的血管中流动时会产生阴影。支点相对于血管的角度可用于计算红细胞流速。还通过向小鼠注射荧光微球来量化红细胞速度，并将其轨迹长度除以帧采集时间。

静止和流动的微球是可区分的。通过连续成像跟踪播散性肿瘤细胞的命运，在几天内使用窗口对肺进行高分辨率成像。肿瘤细胞在第一天到达并停留在肺血管系统中。

然而，在第二天和第三天没有在肺血管系统中检测到细胞，表明再循环或外渗。从肿瘤细胞到达开始，可视化肺转移进展的高潮步骤，肿瘤细胞外渗到肺实质和增殖形成宏观转移。注意避免在光学窗框放置期间对肺部造成创伤。

肺部容易出血，这随后会阻碍在放置过程中覆盖滑移的粘附。在此程序之后可以执行的其他方法包括活体显微镜检查，当与改进的显微标本方法一起使用时，可以精确地重新定位感兴趣的区域以进行重复成像。该协议允许在研究有关转移机制的关键问题时可视化肺。

这项研究有可能为癌症患者重建一种新的治疗方法。