L’inclinaison de l’étage de l’échantillon fournit un moyen simple et généralisable d’augmenter la distribution d’orientation des particules lors de la collecte de données cryo-EM à une seule particule. La distribution uniforme des particules obtenue grâce à l’inclinaison de l’étage de l’échantillon permet d’améliorer la qualité globale de la carte et l’interprétabilité. Commencez par aligner le microscope pour assurer un éclairage parallèle de l’échantillon et minimiser les aberrations de coma.
Pour identifier les carrés appropriés pour la collecte de données, enregistrez un atlas de grille sans inclinaison de scène ou avec inclinaison de scène, qui fournit une vue d’ensemble de la qualité globale de la grille et une indication initiale des zones appropriées pour la collecte de données. Inspectez manuellement les carrés au grossissement utilisé dans le nœud d’acquisition de carrés. Recherchez les carrés où la feuille est intacte, n’a pas l’air déshydratée et a une épaisseur de glace idéale, et déplacez le stade du spécimen vers un carré d’intérêt.
Déterminez la hauteur eucentrique pour la position de la scène à l’aide d’un oscillant alpha à une inclinaison de scène d’environ 15 degrés et ajustez la hauteur Z pour amener la scène à la hauteur eucentrique à l’aide du panneau du clavier pour le microscope. Assurez-vous que le décalage de l’image est minimal pendant la routine d’oscillation alpha. Pour trouver une hauteur Z plus précise, estimez-la dans le nœud de focalisation au grossissement utilisé dans le nœud d’acquisition carrée.
Ajustez les paramètres du nœud de mise au point et activez ou désactivez l’option de mise au point Z fine lors de la mise en file d’attente initiale des carrés. Appuyez ensuite sur Simuler. Inclinez l’étage de l’échantillon à l’angle d’inclinaison souhaité pour la collecte de données à la hauteur eucentrique réelle et recentrez l’étage si nécessaire.
Appuyez sur Simuler dans le nœud d’acquisition carré pour commencer à mettre en file d’attente les cibles pour les expositions de nœud d’acquisition entier. Ensuite, sélectionnez une cible de mise au point Z et des régions avec des trous adaptés aux expositions à fort grossissement et soumettez les cibles à la file d’attente pour l’imagerie. Ramenez le stade de l’échantillon à son état non incliné, puis passez au carré suivant.
Répétez ces étapes jusqu’à ce qu’un nombre suffisant d’expositions entières aient été mises en file d’attente. Une fois que tous les carrés sont mis en file d’attente, accédez à l’ensemble du nœud de ciblage et appuyez sur Soumettre les cibles en file d’attente. Sélectionnez Autoriser l’utilisateur à vérifier les cibles sélectionnées dans les paramètres du nœud et inspectez manuellement les cibles sélectionnées par le nœud d’acquisition d’exposition à fort grossissement pour tester si le détecteur de trous EM automatisé peut identifier avec précision les régions appropriées pour l’acquisition d’images lorsque l’étage de l’échantillon est incliné.
Une fois que l’utilisateur est satisfait de la précision du ciblage, désélectionnez l’option Autoriser la vérification par l’utilisateur des cibles sélectionnées pour la collecte automatisée des données. Les images représentatives de la grille à grossissement carré avec différents angles d’inclinaison collectés près et loin de la hauteur Z eucentrique sont montrées ici. Le centre du faisceau est indiqué par le centre des anneaux concentriques rouges et la flèche verte indique le carré d’intérêt.
Il y a une grille brisée adjacente au carré d’intérêt pour référence. Les expositions représentatives des trous et les moyennes de classe 2D collectées à des angles d’inclinaison de 0 degré, 30 degrés et 60 degrés. Bien que la concentration de protéines soit inchangée selon les différents angles d’inclinaison, un angle d’inclinaison plus élevé rend la zone imagée plus encombrée en termes de concentration de particules.
Les moyennes des classes 2D affectées par le surpeuplement sont indiquées dans cet encadré rouge. La simplicité du protocole permet à tout utilisateur standard du microscope d’adapter facilement une stratégie de collecte de données inclinée.
