يصف هذا البروتوكول كيفية تربية الديدان وتحويل العوالم الدقيقة إلى سماد ، مما يتيح الاستكشاف داخل المختبر لتفاعلات الميكروبيوم المضيف في سياق يشبه الطبيعة. توفر هذه الطريقة بديلا لعزل الديدان البرية عن الطبيعة أو استخدام مجتمعات ميكروبية اصطناعية ذات تنوع ميكروبي محدود. هذا البروتوكول واضح ومباشر ويمكن إجراؤه في أي مختبر وهو مناسب للمبتدئين.
للبدء ، احصل على السماد أو تربة الحديقة من أي مصدر مناسب وقم بتخزينه داخل المختبر في حاوية بلاستيكية قياسية للمطبخ مع فتحات مقطوعة في الغطاء للتهوية. سد الثقوب بالصوف القطني لإبعاد ذباب الفاكهة واللافقاريات الأخرى. قم بإثراء السماد أو التربة بالمنتجات المفرومة أو خليط من المنتجات المختلفة في التربة لإنتاج نسبة اثنين إلى واحد من الكتلة.
اخلطي السماد مرة واحدة يوميا وأضيفي وسط M9 حسب الحاجة للحفاظ على الرطوبة دون جعلها موحلة. لكل صورة مصغرة ، أضف 10 جرامات من السماد المخصب إلى كأس زجاجية سعة 30 ملليلتر مغطاة بورق القصدير. أضف 30 جراما من السماد المخصب إلى كل أنبوب سعة 50 ملليلتر.
املأ الأنبوب ب M9 ودوامة. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 560 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. باستخدام ماصة مصلية ، قم بإزالة المواد الطافية دون إزعاج الحبيبات ودمجها في أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر.
ركز المستخلص البكتيري عن طريق طرد الأنبوب بأقصى سرعة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الكريات في M9 بما يكفي للحصول على 200 ميكرولتر لكل عالم مصغر و 200 ميكرولتر للوحة التي ستكون بمثابة وكيل مرئي للعوالم المصغرة. أضف 200 ميكرولتر من المستخلص الميكروبي المركز إلى دورق السماد المعقم ولوحة NGM الوكيلة المرئية.
أضف 500 إلى 1000 يرقة L1 إلى كل صورة مصغرة ولوحة الوكيل. قم بتبطين أنبوب PVC أسطواني بالمناديل الورقية. يجب أن تحتوي هذه الأسطوانة على شبكة نايلون ملليمتر واحد ملتصقة في قاعها في القمع.
ضع الأسطوانة في قمع بيرمان جالسا في قارورة. أضف 20 ملليلتر من M9 إلى العالم المصغر للدودة. حرك الخليط ثم صب الخليط من الكأس الزجاجية في الأسطوانة المبطنة بورق المناديل في إعداد قمع بيرمان.
اغمر السماد في القمع بالكامل عن طريق إضافة المزيد من M9. قم بفك المشبك لتحرير المرشح الذي يحتوي على الديدان المحصودة في أنبوب سعة 50 ملليلتر. ثم ركز الديدان عن طريق طرد الأنبوب عند 560 جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوات واسحب المرشحات من جولات مختلفة إذا رغبت في المزيد من الديدان.
قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة مصلية مع ترك 15 ملليلتر في الأنبوب. انقل السائل المتبقي إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة لزيادة تركيز الديدان. إزالة 14 ملليلتر من الطافي مع ماصة المصلية.
في الوقت نفسه ، اجمع جراما واحدا من تربة العالم المصغر المتبقية في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر أثناء معالجة عينات التربة التي تحتوي على المجتمع البكتيري البيئي كما هو موضح في المخطوطة. انقل ملليلتر واحد من الديدان المركزة المحصودة إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر باستخدام ماصة زجاجية. احتضان لمدة دقيقتين للسماح للديدان بالاستقرار في قاع الأنبوب.
قم بإزالة المادة الطافية مع ترك 100 ميكرولتر من الحبيبات دون إزعاج في قاع الأنبوب. اغسل الحبيبات ب 1.5 ملليلتر من M9 plus Triton X ، مما يسمح للديدان بالاستقرار في القاع في كل مرة. نقل الديدان المغسولة في حجم 100 ميكرولتر إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر باستخدام ماصة زجاجية.
لشل الديدان ، أضف 100 ميكرولتر من 25 ملليمولار ليفاميزول هيدروكلوريد واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف 200 ميكرولتر من محلول التبييض بنسبة 4٪ واحتضانه لمدة دقيقتين. قم بإزالة المادة الطافية تاركة 150 ميكرولترا في القاع دون عائق ، واغسل حبيبات الدودة ثلاث مرات باستخدام M9 plus Triton X.يمكن تخزين هذه الديدان المعقمة سطحيا عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام ويمكن استخدامها لاحقا للتطبيقات النهائية.
أظهرت مقارنة ميكروبيوم الأمعاء الدودية والمجتمعات البيئية باستخدام تحليل الإحداثيات الأساسي بناء على مسافة UniFrac غير المرجحة أو المرجحة تجمعا متميزا لميكروبيوم الأمعاء الدودية بعيدا عن تلك الموجودة في بيئاتها الخاصة. في حين أن تحليل الإحداثيات الأساسي القائم على مسافات UniFrac غير المرجحة لم يميز بين ميكروبيوم التربة والديدان ، فإن التجميع القائم على المسافات المرجحة كشف عن فصل واضح بين أمعاء الدودة وميكروبيوم السماد. في هذه الدراسة ، تم استخدام الديدان التي أثيرت في عوالم مصغرة للسماد لتسلسل 16S ، ولكن يمكن استخدامها أيضا لاختبار تأثيرات الميكروبات البيئية المختلفة على مقاومة المضيف للظروف المعاكسة.
بدلا من ذلك ، يمكن عزل الأصناف البكتيرية الجديدة من الديدان التي يتم حصادها من العوالم المصغرة للسماد من أجل توسيع التنوع التصنيفي والوظيفي المعروف لأمعاء الدودة. بعد تطويره ، سهل خط أنابيب العوالم المصغرة تقييم مساهمات العوامل الوراثية البيئية مقابل العوامل الوراثية المضيفة في تشكيل ميكروبيوم الأمعاء.
