이 프로토콜은 벌레를 키우고 소우주를 퇴비화하는 방법을 설명하여 자연과 유사한 맥락에서 숙주-미생물 군집 상호 작용의 실험실 내 탐색을 가능하게합니다. 이 방법은 야생 벌레를 자연에서 분리하거나 제한된 미생물 다양성의 합성 미생물 군집을 사용하는 대안을 제공합니다. 이 프로토콜은 간단하며 모든 실험실에서 수행할 수 있으며 초보자에게도 적합합니다.
시작하려면 편리한 출처에서 퇴비 또는 정원 토양을 구하여 폭기를 위해 뚜껑에 구멍이 뚫린 표준 주방 플라스틱 용기에 실험실 내부에 보관하십시오. 초파리와 다른 무척추 동물을 막기 위해 탈지면으로 구멍을 막으십시오. 다진 농산물 또는 토양에 다른 농산물의 혼합물로 퇴비 또는 토양을 풍부하게하여 질량 기준으로 2 : 1의 비율을 생성합니다.
퇴비를 하루에 한 번 혼합하고 필요에 따라 M9 배지를 추가하여 진흙 투성이가 되지 않고 수분을 유지합니다. 각 소우주에 대해 은박지로 덮인 30 밀리리터 유리 비커에 10 그램의 농축 퇴비를 첨가하십시오. 각 50 밀리리터 튜브에 30 그램의 농축 퇴비를 첨가하십시오.
튜브에 M9와 와류를 채 웁니다. 실온에서 5 분 동안 560G의 튜브를 원심 분리합니다. 혈청 학적 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거하고 새로운 50 밀리리터 튜브에 결합하십시오.
실온에서 15분 동안 튜브를 최대 속도로 원심분리하여 박테리아 추출물을 농축합니다. 각 소우주에 대해 9마이크로리터, 소우주의 가시적인 프록시 역할을 할 플레이트에 대해 200마이크로리터가 되도록 충분한 M200에 펠릿을 재현탁합니다. 200 마이크로 리터의 농축 미생물 추출물을 오토 클레이브 퇴비 비커와 가시적 인 프록시 NGM 플레이트에 추가합니다.
500-1000 L1 유충을 각 소우주와 프록시 플레이트에 추가하십시오. 원통형 PVC 파이프에 티슈 페이퍼를 깔아 놓습니다. 이 실린더에는 깔때기의 바닥에 1mm 나일론 메쉬가 붙어 있어야합니다.
플라스크에 있는 Baermann 깔때기에 실린더를 놓습니다. 웜 소우주에 20 밀리리터의 M9를 추가하십시오. 혼합물을 교반한 다음 비커의 혼합물을 Baermann 깔때기 설정의 티슈 페이퍼가 늘어선 실린더에 붓습니다.
M9를 더 추가하여 깔때기에 퇴비를 완전히 담그십시오. 클램프를 풀어 수확 된 벌레가 들어있는 여과액을 50 밀리리터 튜브로 방출합니다. 그런 다음 실온에서 2 분 동안 튜브를 560G에서 원심 분리하여 웜을 농축하십시오. 이 단계를 반복하고 더 많은 웜이 필요한 경우 다른 라운드에서 여과액을 가져옵니다.
튜브에 15 밀리리터를 남겨두고 혈청 학적 피펫으로 상청액을 제거하십시오. 남은 액체를 15 밀리리터 튜브로 옮기고 1 분 동안 다시 원심 분리하여 웜을 더욱 농축시킵니다. 혈청 학적 피펫으로 상청액 14 밀리리터를 제거하십시오.
동시에 나머지 소우주 토양 1g을 1.5 밀리리터 튜브에 모으고 원고에 설명 된대로 환경 박테리아 군집을 포함하는 토양 샘플을 처리합니다. 농축 수확 된 벌레 1 밀리리터를 유리 피펫을 사용하여 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 벌레가 튜브 바닥에 정착 할 수 있도록 2 분 동안 배양하십시오.
튜브 바닥에 100마이크로리터의 펠릿을 그대로 두고 상청액을 제거합니다. 1.5 밀리리터의 M9와 트리톤 X로 펠릿을 씻어 매번 벌레가 바닥에 정착하도록합니다. 세척 된 웜을 100 마이크로 리터의 부피로 유리 피펫을 사용하여 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다.
벌레를 마비 시키려면 100 마이크로 리터의 25 밀리몰 levamisole 하이드로 클로라이드를 넣고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 200 마이크로 리터의 4 % 표백제 용액을 넣고 2 분 동안 배양하십시오. 맨 아래 150 마이크로 리터를 방해하지 않고 상청액을 제거하고 M9와 Triton X로 웜 펠릿을 세 번 씻으십시오.이 표면 멸균 된 웜은 사용할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있으며 나중에 다운 스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다.
가중치가 없거나 가중 UniFrac 거리를 기반으로 한 원리 좌표 분석을 사용하여 웜 장내 미생물군집과 환경 군집을 비교한 결과, 웜 장내 미생물군집이 각각의 환경에 있는 미생물군집과 뚜렷하게 클러스터링되는 것으로 나타났습니다. 가중치가 적용되지 않은 UniFrac 거리를 기반으로 한 원리 좌표 분석은 토양과 벌레 미생물군집을 구별하지 못했지만 가중 거리를 기반으로 한 클러스터링은 벌레 장과 퇴비 미생물군집의 명확한 분리를 보여주었습니다. 이 연구에서는 퇴비 소우주에서 자란 벌레를 16S 시퀀싱에 사용했지만 불리한 조건에 대한 숙주 저항에 대한 다양한 환경 미생물군집의 영향을 테스트하는 데에도 사용할 수 있습니다.
대안적으로, 새로운 박테리아 분류군은 퇴비 소우주에서 수확 된 벌레로부터 분리 될 수 있으며, 이는 벌레 장 공생의 알려진 분류 학적 및 기능적 다양성을 확장하기 위해서이다. 개발 후 소우주 파이프 라인은 장내 미생물 군집을 형성하는 데있어 환경 대 숙주 유전 적 요인의 기여도를 평가하는 것을 용이하게했습니다.
