このプロトコルは、ワームを飼育し、ミクロコズムを堆肥化する方法を説明しており、自然のような状況で宿主と微生物叢の相互作用をラボ内で調査できるようにします。この方法は、野生のワームを自然から分離したり、微生物の多様性が限られている合成微生物群集を使用したりする代替手段を提供します。このプロトコルは簡単で、どのラボでも実行でき、初心者にも適しています。
はじめに、都合の良い供給源から堆肥や庭の土を入手し、通気のために蓋に穴を開けた標準的な台所のプラスチック容器に実験室内に保管します。ショウジョウバエや他の無脊椎動物を防ぐために、脱脂綿で穴を塞ぎます。堆肥または土壌を刻んだ農産物または土壌中の異なる農産物の混合物で濃縮して、質量比で2対1の比率を生成します。
堆肥を1日1回混合し、必要に応じてM9培地を加えて、泥だらけにせずに水分を維持します。小宇宙ごとに、ティンフォイルで覆われた30ミリリットルのガラスビーカーに10グラムの濃縮堆肥を加えます。各50ミリリットルのチューブに30グラムの濃縮堆肥を追加します。
チューブをM9と渦で満たします。チューブを560 Gで室温で5分間遠心分離します。血清学的ピペットを使用して、ペレットを乱すことなく上清を取り除き、それらを新しい50ミリリットルチューブに混ぜ合わせます。
チューブを最高速度で室温で15分間遠心分離することにより、細菌抽出物を濃縮します。ペレットを十分なM9に再懸濁して、各小宇宙に200マイクロリットル、小宇宙の目に見えるプロキシとして機能するプレートに200マイクロリットルを入れます。200マイクロリットルの濃縮微生物抽出物をオートクレーブ処理された堆肥ビーカーと目に見えるプロキシNGMプレートに追加します。
各小宇宙とプロキシプレートに500〜1000匹のL1幼虫を追加します。円筒形のPVCパイプにティッシュペーパーを敷きます。このシリンダーには、漏斗の底に1ミリメートルのナイロンメッシュが接着されている必要があります。
フラスコに座っているベアマン漏斗にシリンダーを置きます。ワームの小宇宙に20ミリリットルのM9を追加します。混合物を攪拌してから、ビーカーからベアマンファンネルセットアップのティッシュペーパーで裏打ちされたシリンダーに混合物を注ぎます。
M9を追加して、堆肥を漏斗に完全に沈めます。クランプを外して、収穫したワームを含むろ液を50ミリリットルのチューブに放出します。次に、チューブを560 Gで室温で2分間遠心分離してワームを濃縮します。これらの手順を繰り返し、より多くのワームが必要な場合は、異なるラウンドからろ液を引き出します。
チューブに15ミリリットルを残しながら、血清学的ピペットで上清を除去します。残りの液体を15ミリリットルのチューブに移し、再び1分間遠心分離してワームをさらに濃縮します。血清学的ピペットで14ミリリットルの上清を除去する。
同時に、原稿に記載されているように、環境細菌群集を含む土壌サンプルを処理しながら、残りの小宇宙土壌1グラムを1.5ミリリットルのチューブに集めます。ガラスピペットを使用して、濃縮された1ミリリットルのワームを1.5ミリリットルのチューブに移します。ワームがチューブの底に落ち着くように2分間インキュベートします。
チューブの底に100マイクロリットルのペレットを乱さずに残しながら上清を取り除きます。ペレットを1.5ミリリットルのM9とTriton Xで洗浄し、ワームが毎回底に定着するようにします。ガラスピペットを使用して、洗浄したワームを100マイクロリットルの容量で新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。
ワームを麻痺させるには、100マイクロリットルの25ミリモルの塩酸レバミゾールを加え、室温で5分間インキュベートします。200マイクロリットルの4%漂白剤溶液を加え、2分間インキュベートします。最下部の150マイクロリットルを乱さずに上清を取り除き、ワームペレットをM9とTriton X.これらの表面滅菌ワームで3回洗浄し、使用するまで摂氏マイナス20度で保存でき、後でダウンストリームアプリケーションに使用できます。
非加重または加重UniFrac距離に基づく原理座標分析を使用して、ワーム腸内細菌叢と環境コミュニティを比較すると、それぞれの環境の微生物叢から離れたワーム腸内細菌叢の明確なクラスター化が示されました。重み付けされていないUniFrac距離に基づく原理座標分析では、土壌とワームのマイクロバイオームは区別されませんでしたが、重み付けされた距離に基づくクラスタリングでは、ワームの腸と堆肥のマイクロバイオームの明確な分離が明らかになりました。この研究では、堆肥の小宇宙で育てられたワームを16Sシーケンシングに使用しましたが、悪条件に対する宿主の耐性に対するさまざまな環境微生物叢の影響をテストするためにも使用できます。
あるいは、新しい細菌分類群を堆肥の小宇宙から収穫したワームから分離して、ワーム腸共生の既知の分類学的および機能的多様性を拡大することができます。その開発後、マイクロコズムパイプラインは、腸内細菌叢の形成における環境と宿主の遺伝的要因の寄与の評価を容易にしました。
