Este protocolo describe cómo criar gusanos y compostar microcosmos, lo que permite la exploración en el laboratorio de las interacciones huésped-microbioma en un contexto natural. Este método ofrece una alternativa al aislamiento de gusanos silvestres de la naturaleza o al uso de comunidades microbianas sintéticas de diversidad microbiana limitada. Este protocolo es sencillo y se puede realizar en cualquier laboratorio e incluso es adecuado para principiantes.
Para comenzar, obtenga compost o tierra de jardín de cualquier fuente conveniente y guárdelo dentro del laboratorio en un recipiente de plástico de cocina estándar con agujeros cortados en la tapa para aireación. Tapa los agujeros con algodón para mantener alejadas a las moscas de la fruta y otros invertebrados. Enriquezca el compost o el suelo con productos picados o una mezcla de diferentes productos en el suelo para producir una proporción de dos a uno por masa.
Mezcle el compost una vez al día y agregue M9 medio según sea necesario para mantener la humedad sin enturbiarlo. Para cada microcosmos, agregue 10 gramos de compost enriquecido a un vaso de precipitados de vidrio de 30 mililitros cubierto con papel de aluminio. Agregue 30 gramos de compost enriquecido a cada tubo de 50 mililitros.
Llene el tubo con M9 y vórtice. Centrifugar los tubos a 560 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Con una pipeta serológica, retire los sobrenadantes sin alterar el pellet y combínelos en un nuevo tubo de 50 mililitros.
Concentrar el extracto bacteriano centrifugando el tubo a velocidad máxima durante 15 minutos a temperatura ambiente. Resuspenda los gránulos en suficiente M9 para tener 200 microlitros para cada microcosmos y 200 microlitros para una placa que servirá como un proxy visible para el microcosmos. Agregue 200 microlitros del extracto microbiano concentrado al vaso de precipitados de compost esterilizado en autoclave y a la placa NGM proxy visible.
Agregue de 500 a 1000 larvas L1 a cada microcosmos y a la placa proxy. Forra una tubería cilíndrica de PVC con papel de seda. Este cilindro debe tener una malla de nylon de un milímetro pegada en su parte inferior en el embudo.
Coloque el cilindro en el embudo Baermann sentado en un matraz. Agregue 20 mililitros de M9 al microcosmos del gusano. Agite la mezcla y luego vierta la mezcla del vaso de precipitados en el cilindro forrado de papel de seda en la configuración del embudo Baermann.
Sumerge el compost en el embudo por completo agregando más M9. Desabrocha la abrazadera para liberar el filtrado que contiene los gusanos cosechados en un tubo de 50 mililitros. A continuación, concentrar los gusanos centrifugando el tubo a 560 G durante dos minutos a temperatura ambiente. Repita estos pasos y extraiga los filtrados de diferentes rondas si desea más gusanos.
Retire el sobrenadante con una pipeta serológica dejando 15 mililitros en el tubo. Transfiera el líquido restante a un tubo de 15 mililitros y centrifugar nuevamente durante un minuto para concentrar aún más los gusanos. Retire 14 mililitros del sobrenadante con una pipeta serológica.
Simultáneamente, recolecte un gramo del suelo del microcosmos restante en un tubo de 1.5 mililitros mientras procesa las muestras de suelo que contienen la comunidad bacteriana ambiental como se describe en el manuscrito. Transfiera un mililitro de los gusanos cosechados concentrados a un tubo de 1,5 mililitros usando una pipeta de vidrio. Incubar durante dos minutos para permitir que los gusanos se asienten en el fondo del tubo.
Retire el sobrenadante dejando 100 microlitros del pellet sin perturbar en el fondo del tubo. Lave el pellet con 1,5 mililitros de M9 más Triton X, permitiendo que los gusanos se asienten en el fondo cada vez. Transfiera los gusanos lavados en un volumen de 100 microlitros a un nuevo tubo de 1,5 mililitros con una pipeta de vidrio.
Para paralizar los gusanos, agregue 100 microlitros de clorhidrato de levamisol 25 milimolar e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Agregue 200 microlitros de solución de lejía al 4% e incube durante dos minutos. Retire el sobrenadante dejando los 150 microlitros más bajos sin alterar, y lave el pellet de gusano tres veces con M9 más Triton X.Estos gusanos esterilizados en la superficie se pueden almacenar a menos 20 grados centígrados hasta su uso y se pueden usar más tarde para aplicaciones posteriores.
La comparación de los microbiomas intestinales de gusanos y las comunidades ambientales utilizando el análisis de coordenadas principales basado en la distancia UniFrac no ponderada o ponderada mostró una agrupación distinta de microbiomas intestinales de gusanos lejos de los de sus respectivos entornos. Si bien el análisis de coordenadas principales basado en distancias UniFrac no ponderadas no distinguió entre microbiomas de suelo y gusanos, la agrupación basada en distancias ponderadas reveló una clara separación de los microbiomas intestinales y de compost de gusanos. En este estudio, los gusanos criados en microcosmos de compost se utilizaron para la secuenciación 16S, pero también se pueden usar para probar los efectos de diferentes microbiomas ambientales en la resistencia del huésped a condiciones adversas.
Alternativamente, se pueden aislar nuevos taxones bacterianos de gusanos cosechados de microcosmos de compost para expandir la diversidad taxonómica y funcional conocida de los comensales intestinales de gusanos. Después de su desarrollo, la tubería de microcosmos facilitó la evaluación de las contribuciones de los factores ambientales versus los factores genéticos del huésped en la configuración del microbioma intestinal.
