Este protocolo descreve como criar vermes e microcosmos de compostagem, permitindo a exploração em laboratório das interações hospedeiro-microbioma em um contexto natural. Este método oferece uma alternativa ao isolamento de vermes selvagens da natureza ou ao uso de comunidades microbianas sintéticas de diversidade microbiana limitada. Este protocolo é simples e pode ser realizado em qualquer laboratório e é até mesmo adequado para iniciantes.
Para começar, obtenha composto ou solo de jardim de qualquer fonte conveniente e armazene-o dentro do laboratório em um recipiente de plástico de cozinha padrão com furos cortados na tampa para aeração. Tape os buracos com algodão para manter as moscas da fruta e outros invertebrados fora. Enriqueça o composto ou o solo com produtos picados ou uma mistura de produtos diferentes no solo para produzir uma proporção de dois para um em massa.
Misture o composto uma vez por dia e adicione o meio M9 conforme necessário para manter a umidade sem torná-la lamacenta. Para cada microcosmo, adicione 10 gramas de composto enriquecido a um copo de vidro de 30 mililitros coberto com tinfoil. Adicione 30 gramas de composto enriquecido a cada tubo de 50 mililitros.
Encha o tubo com M9 e vórtice. Centrifugar os tubos a 560 G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Usando uma pipeta sorológica, remova os sobrenadantes sem perturbar o pellet e combine-os em um novo tubo de 50 mililitros.
Concentrar o extracto bacteriano centrifugando o tubo à velocidade máxima durante 15 minutos à temperatura ambiente. Ressuspenda os pellets em M9 suficiente para ter 200 microlitros para cada microcosmo e 200 microlitros para uma placa que servirá como um proxy visível para microcosmos. Adicionar 200 microlitros do extrato microbiano concentrado ao copo de composto autoclavado e à placa NGM proxy visível.
Adicione 500 a 1000 larvas L1 a cada microcosmo e à placa proxy. Forre um tubo de PVC cilíndrico com papel de seda. Este cilindro deve ter uma malha de nylon de um milímetro colada em seu fundo no funil.
Colocar o cilindro no funil Baermann num balão. Adicione 20 mililitros de M9 ao microcosmo do verme. Agite a mistura e, em seguida, despeje a mistura do copo no cilindro revestido de papel de tecido na configuração do funil Baermann.
Submerja o composto no funil inteiramente adicionando mais M9. Desprenda o grampo para liberar o filtrado contendo os vermes colhidos em um tubo de 50 mililitros. Em seguida, concentre os vermes centrifugando o tubo a 560 G por dois minutos à temperatura ambiente. Repita estes passos e puxe os filtrados de diferentes rodadas se mais vermes forem desejados.
Remova o sobrenadante com uma pipeta sorológica, deixando 15 mililitros no tubo. Transfira o líquido restante para um tubo de 15 mililitros e centrifugar novamente por um minuto para concentrar ainda mais os vermes. Remova 14 mililitros do sobrenadante com uma pipeta sorológica.
Simultaneamente, colete um grama do solo do microcosmo restante em um tubo de 1,5 mililitro enquanto processa as amostras de solo contendo a comunidade bacteriana ambiental, conforme descrito no manuscrito. Transfira um mililitro dos vermes colhidos concentrados para um tubo de 1,5 mililitro usando uma pipeta de vidro. Incube por dois minutos para permitir que os vermes se depositem no fundo do tubo.
Remova o sobrenadante deixando 100 microlitros do pellet intactos na parte inferior do tubo. Lave o pellet com 1,5 mililitros de M9 mais Triton X, permitindo que os vermes se depositem no fundo a cada vez. Transfira os vermes lavados em um volume de 100 microlitros para um novo tubo de 1,5 mililitro usando uma pipeta de vidro.
Para paralisar os vermes, adicione 100 microlitros de cloridrato de levamisol 25 milimolares e incube por cinco minutos à temperatura ambiente. Adicionar 200 microlitros de solução de alvejante a 4% e incubar durante dois minutos. Remova o sobrenadante deixando o fundo de 150 microlitros intacto e lave o pellet de minhoca três vezes com M9 mais Triton X.Estes vermes esterilizados por superfície podem ser armazenados a menos 20 graus Celsius até o uso e podem ser usados mais tarde para aplicações a jusante.
A comparação dos microbiomas intestinais de vermes e comunidades ambientais usando a análise de coordenadas de princípio com base na distância UniFrac não ponderada ou ponderada mostrou agrupamento distinto de microbiomas intestinais de vermes longe daqueles em seus respectivos ambientes. Embora a análise de coordenadas de princípio baseada em distâncias UniFrac não ponderadas não tenha distinguido entre microbiomas de solo e vermes, o agrupamento baseado em distâncias ponderadas revelou uma clara separação dos microbiomas intestinais e compostos de vermes. Neste estudo, vermes criados em microcosmos de composto foram utilizados para sequenciamento de 16S, mas também podem ser usados para testar os efeitos de diferentes microbiomas ambientais na resistência do hospedeiro a condições adversas.
Alternativamente, novos táxons bacterianos podem ser isolados de vermes colhidos de microcosmos de composto, a fim de expandir a diversidade taxonômica e funcional conhecida de comensais intestinais de vermes. Após seu desenvolvimento, o pipeline de microcosmos facilitou a avaliação das contribuições de fatores genéticos ambientais versus hospedeiros na formação do microbioma intestinal.
