Ce protocole décrit comment élever des vers et composter des microcosmes, permettant l’exploration en laboratoire des interactions hôte-microbiome dans un contexte naturel. Cette méthode offre une alternative à l’isolement des vers sauvages de la nature ou à l’utilisation de communautés microbiennes synthétiques de diversité microbienne limitée. Ce protocole est simple et peut être exécuté dans n’importe quel laboratoire et convient même aux débutants.
Pour commencer, procurez-vous du compost ou de la terre de jardin de n’importe quelle source pratique et stockez-le à l’intérieur du laboratoire dans un récipient en plastique de cuisine standard avec des trous percés dans le couvercle pour l’aération. Boucher les trous avec du coton pour empêcher les mouches des fruits et autres invertébrés d’entrer. Enrichissez le compost ou le sol avec des produits hachés ou un mélange de différents produits dans le sol pour produire un rapport de deux pour un en masse.
Mélangez le compost une fois par jour et ajoutez le milieu M9 au besoin pour maintenir l’humidité sans le rendre boueux. Pour chaque microcosme, ajoutez 10 grammes de compost enrichi à un bécher en verre de 30 millilitres recouvert de papier d’aluminium. Ajouter 30 grammes de compost enrichi à chaque tube de 50 millilitres.
Remplissez le tube avec M9 et vortex. Centrifuger les tubes à 560 G pendant cinq minutes à température ambiante. À l’aide d’une pipette sérologique, retirez les surnageants sans déranger la pastille et combinez-les dans un nouveau tube de 50 millilitres.
Concentrer l’extrait bactérien en centrifugeant le tube à vitesse maximale pendant 15 minutes à température ambiante. Remettez les granulés en suspension dans suffisamment de M9 pour avoir 200 microlitres pour chaque microcosme et 200 microlitres pour une plaque qui servira de proxy visible pour les microcosmes. Ajouter 200 microlitres de l’extrait microbien concentré au bécher de compost autoclavé et à la plaque de NGM proxy visible.
Ajouter 500 à 1000 larves L1 à chaque microcosme et à la plaque proxy. Tapisser un tuyau cylindrique en PVC de papier de soie. Ce cylindre doit avoir un treillis de nylon d’un millimètre collé à son fond dans l’entonnoir.
Placer le cylindre dans l’entonnoir Baermann placé dans une fiole. Ajoutez 20 millilitres de M9 au microcosme du ver. Agitez le mélange, puis versez le mélange du bécher dans le cylindre doublé de papier de soie dans la configuration de l’entonnoir Baermann.
Immergez entièrement le compost dans l’entonnoir en ajoutant plus de M9. Détachez la pince pour libérer le filtrat contenant les vers récoltés dans un tube de 50 millilitres. Concentrez ensuite les vers en centrifugeant le tube à 560 G pendant deux minutes à température ambiante. Répétez ces étapes et tirez les filtrrats de différents cycles si vous souhaitez plus de vers.
Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique tout en laissant 15 millilitres dans le tube. Transférer le liquide restant dans un tube de 15 millilitres et centrifuger à nouveau pendant une minute pour concentrer davantage les vers. Retirez 14 millilitres du surnageant à l’aide d’une pipette sérologique.
Simultanément, recueillir un gramme du sol du microcosme restant dans un tube de 1,5 millilitre tout en traitant les échantillons de sol contenant la communauté bactérienne environnementale décrite dans le manuscrit. Transférer un millilitre des vers récoltés concentrés dans un tube de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette en verre. Incuber pendant deux minutes pour permettre aux vers de s’installer au fond du tube.
Retirez le surnageant tout en laissant 100 microlitres de la pastille intacte au fond du tube. Lavez la pastille avec 1,5 millilitre de M9 plus Triton X, permettant aux vers de se déposer au fond à chaque fois. Transférer les vers lavés dans un volume de 100 microlitres dans un nouveau tube de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette en verre.
Pour paralyser les vers, ajoutez 100 microlitres de chlorhydrate de lévamisole 25 millimolaires et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Ajouter 200 microlitres de solution d’eau de Javel à 4% et incuber pendant deux minutes. Retirez le surnageant en laissant intact les 150 microlitres les plus bas et lavez la pastille de ver trois fois avec M9 plus Triton X.Ces vers stérilisés en surface peuvent être stockés à moins 20 degrés Celsius jusqu’à leur utilisation et peuvent être utilisés ultérieurement pour des applications en aval.
La comparaison des microbiomes intestinaux des vers et des communautés environnementales à l’aide d’une analyse des coordonnées de principe basée sur une distance UniFrac non pondérée ou pondérée a montré un regroupement distinct des microbiomes intestinaux des vers loin de ceux de leurs environnements respectifs. Alors que l’analyse des coordonnées de principe basée sur les distances UniFrac non pondérées n’a pas fait la distinction entre les microbiomes du sol et ceux des vers, le regroupement basé sur les distances pondérées a révélé une séparation claire des microbiomes intestinaux et compost des vers. Dans cette étude, des vers élevés dans des microcosmes de compost ont été utilisés pour le séquençage du 16S, mais peuvent également être utilisés pour tester les effets de différents microbiomes environnementaux sur la résistance de l’hôte à des conditions défavorables.
Alternativement, de nouveaux taxons bactériens peuvent être isolés à partir de vers récoltés dans des microcosmes de compost afin d’élargir la diversité taxonomique et fonctionnelle connue des commensaux intestinaux des vers. Après son développement, le pipeline de microcosmes a facilité l’évaluation des contributions des facteurs environnementaux par rapport aux facteurs génétiques de l’hôte dans la formation du microbiome intestinal.
