Этот протокол описывает, как выращивать червей и компостные микрокосмы, что позволяет исследовать в лаборатории взаимодействия хозяина и микробиома в естественном контексте. Этот метод предлагает альтернативу выделению диких червей от природы или использованию синтетических микробных сообществ с ограниченным микробным разнообразием. Этот протокол прост и может быть выполнен в любой лаборатории и даже подходит для начинающих.
Для начала получите компост или садовую почву из любого удобного источника и храните ее внутри лаборатории в стандартном кухонном пластиковом контейнере с отверстиями, вырезанными в крышке для аэрации. Заткните отверстия ватой, чтобы не допустить плодовых мушек и других беспозвоночных. Обогатите компост или почву измельченным продуктом или смесью различных продуктов в почве, чтобы получить соотношение два к одному по массе.
Смешивайте компост один раз в день и добавляйте среду M9 по мере необходимости, чтобы сохранить влагу, не делая ее грязной. Для каждого микромира добавьте 10 граммов обогащенного компоста в стеклянный стакан объемом 30 миллилитров, покрытый фольгой. Добавьте 30 граммов обогащенного компоста в каждую 50-миллилитровую трубку.
Заполните трубку М9 и вихрем. Центрифугируйте пробирки при 560 Г в течение пяти минут при комнатной температуре. Используя серологическую пипетку, удалите супернатанты, не нарушая гранулу, и объедините их в новую 50-миллилитровую трубку.
Концентрируйте бактериальный экстракт путем центрифугирования трубки на максимальной скорости в течение 15 минут при комнатной температуре. Повторно суспендируйте гранулы в достаточном количестве M9, чтобы иметь 200 микролитров для каждого микромира и 200 микролитров для пластины, которая будет служить видимым прокси для микрокосмов. Добавьте 200 микролитров концентрированного микробного экстракта в автоклавный компостный стакан и видимую прокси-пластину NGM.
Добавьте от 500 до 1000 личинок L1 к каждому микрокосму и прокси-пластине. Обложите цилиндрическую трубу из ПВХ папиросной бумагой. Этот цилиндр должен иметь одномиллиметровую нейлоновую сетку, приклеенную в его нижней части в воронке.
Поместите цилиндр в воронку Baermann, сидящую в колбе. Добавьте 20 миллилитров М9 в микромир червя. Перемешайте смесь, а затем перелейте смесь из стакана в цилиндр с подкладкой из папиросной бумаги в воронке Baermann.
Полностью погрузите компост в воронку, добавив еще M9. Отстегните зажим, чтобы освободить фильтрат, содержащий собранных червей, в 50-миллилитровую трубку. Затем концентрируют червей, центрифугируя трубку при 560 г в течение двух минут при комнатной температуре. Повторите эти шаги и извлеките фильтраты из разных раундов, если требуется больше червей.
Удалите супернатант серологической пипеткой, оставив в трубке 15 миллилитров. Переложите оставшуюся жидкость в 15-миллилитровую трубку и снова центрифугируйте в течение одной минуты, чтобы дополнительно сконцентрировать червей. Удалите 14 миллилитров супернатанта серологической пипеткой.
Одновременно соберите один грамм оставшейся почвы микромира в трубку объемом 1,5 миллилитра при обработке образцов почвы, содержащих экологическое бактериальное сообщество, как описано в рукописи. Переложите один миллилитр концентрированных собранных червей в трубку объемом 1,5 миллилитра с помощью стеклянной пипетки. Инкубируйте в течение двух минут, чтобы черви осели на дне трубки.
Удалите супернатант, оставив 100 микролитров гранулы нетронутыми в нижней части трубки. Промывайте гранулу 1,5 миллилитрами M9 плюс Triton X, позволяя червям каждый раз оседать на дне. Переложите промытых червей в объеме 100 микролитров на новую трубку объемом 1,5 миллилитра с помощью стеклянной пипетки.
Чтобы парализовать червей, добавьте 100 микролитров 25 миллимоляров гидрохлорида левамизола и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре. Добавьте 200 микролитров 4% раствора отбеливателя и высиживайте в течение двух минут. Удалите супернатант, оставив самые нижние 150 микролитров нетронутыми, и трижды вымойте гранулы червя M9 плюс Triton X.Эти поверхностно-стерилизованные черви можно хранить при температуре минус 20 градусов цельсия до использования и можно использовать позже для последующих применений.
Сравнение микробиомов кишечника червя и экологических сообществ с использованием принципиального координатного анализа, основанного на невзвешенном или взвешенном расстоянии UniFrac, показало отчетливую кластеризацию микробиомов кишечника червей вдали от тех, которые находятся в их соответствующих средах. В то время как принципиальный координатный анализ, основанный на невзвешенных расстояниях UniFrac, не проводил различия между микробиомами почвы и червей, кластеризация на основе взвешенных расстояний выявила четкое разделение микробиомов кишечника червя и компоста. В этом исследовании черви, выращенные в микрокосмах компоста, использовались для секвенирования 16S, но также могут быть использованы для проверки воздействия различных микробиомов окружающей среды на устойчивость хозяина к неблагоприятным условиям.
В качестве альтернативы, новые бактериальные таксоны могут быть выделены из червей, собранных из компостных микрокосмов, чтобы расширить известное таксономическое и функциональное разнообразие кишечных комменсалов червей. После его разработки конвейер микрокосмов облегчил оценку вклада генетических факторов окружающей среды и хозяина в формирование микробиома кишечника.
