该方法描述了一种新的小鼠模型，用于研究肺炎球菌在病毒感染期间从无症状定植者转变为致病病原体。它更接近于模仿人类发生的事情。该模型可以成为确定易感宿主继发性肺炎球菌肺炎潜在治疗靶点的重要工具。
该模型再现了衰老的易感性。因此，它可以用来了解宿主的哪些方面随着年龄的增长而变得有缺陷，并允许我们为脆弱的老年宿主量身定制治疗方案。生长肺炎球菌生物膜具有挑战性，因为不同的菌株需要不同的时间。
我的建议是在进行动物研究之前尝试生长生物膜。一旦H292细胞100%汇合，用PBS洗涤细胞三次。然后每孔加入250微升4%多聚甲醛以固定细胞，并在冰上孵育一小时或在4摄氏度下孵育过夜。
Strake肺炎链球菌菌株在血琼脂平板上，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育过夜。第二天，将细菌从平板接种到新鲜的化学成分明确的培养基或CDM加氧化酶中，方法是通过加入一毫升CDM加氧酶将细菌从盘子上洗掉，并使用一毫升移液器尖端的侧面轻轻提起细菌菌落，小心不要刮琼脂。将CDM加氧化酶中的细菌培养物稀释至起始OD 600为0.05。
然后将细菌在松散盖的50毫升锥形管中以37摄氏度和5%二氧化碳培养，直到达到0.2的OD。接下来涡旋细菌培养管。在固定的H 292细胞上接种0.5毫升培养物，每孔再加入0.5毫升CDM加氧化酶培养基。
将CDM加氧化酶添加到无细菌的对照孔中。将板在 34 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 48 小时。每12小时，在初始接种后，用新鲜的CDM加Oxyrase轻轻替换0.5毫升的培养基。
注意不要破坏生物膜的形成。检查板底部是否有生物膜，并寻找由于生物膜生长而随着时间的推移而增加的混浊度。48小时后，除去上清液并用一毫升PBS洗涤生物膜两次。
然后将生物膜重悬于一毫升新鲜CDM中，并用力上下移液以提起生物膜。对于每种细菌菌株，将所有孔中的培养物汇集到50毫升管中。轻轻地上下倾斜紧密盖的管子几次，充分混合。
接下来，以等体积加入40%甘油和CDM，以获得终浓度为20%甘油的细菌悬浮液。将一毫升分装到微量离心管中，在干冰上快速冷冻，并在零下80摄氏度下保存。解冻在冰上等分生长的生物膜，并以 1， 700 G 的速度旋转五分钟。
小心地除去并丢弃上清液，而不会破坏沉淀。然后通过将颗粒重悬于一毫升PBS中并再次旋转来洗涤颗粒。除去上清液并将沉淀重悬于达到所需浓度所需的体积中。
通过将5微升稀释的接种物移液到每个鼻孔中，鼻内接种C57黑六雄性小鼠，以五倍10至第六个菌落形成单位或CFU。接种后，牢牢握住小鼠，稳定头部直到吸入体积。病毒解冻后，将PBS中的病毒稀释至所需浓度。
麻醉前将眼科润滑剂放在小鼠的眼睛上。立即用50微升20个斑块形成单位或PFU的甲型流感病毒或IAV感染麻醉小鼠，方法是使用钝镊将舌头从口中拉出并将一定量的液体移入气管。恢复后，使用前面描述的接种方法鼻内接种10微升200 PFU的IAV。
对于肺部收集，使用解剖剪刀，切开暴露的肋骨的两侧，轻轻地将肋骨向上拉向小鼠头部以暴露心脏。将连接到预装有PBS的10毫升注射器的25号针头插入右心室，并开始缓慢灌注。寻找肺部漂白作为成功灌注的指标。
慢慢冲洗以避免破坏肺组织。用镊子提起心脏，切开肺和心脏。分离后，用镊子拾起肺的所有肺叶，并在装有无菌PBS的培养皿中冲洗以去除任何残留的血液。
在培养皿中，将肺切成小块并充分混合。取出一半的肺混合物以确定细菌CFU或病毒PFU，并将其放入预装有0.5毫升PBS的圆底15毫升管中进行均质化。取出另一半肺进行流式细胞术，并将其置于非组织培养处理的24孔板中，每个孔预填充0.5毫升RP10。
在室温下放置直至加工。为了均质收集的组织，通过将均质器探针放入70%乙醇中并以60%功率打开均质器30秒来清洁均质器探针。在无菌水中重复此步骤10秒钟。
使每个组织均质一分钟。为了计数细菌数量，在血琼脂平板上连续稀释。要计算总CFU，请使用10微升进行板，并记下每个样品的最终体积（以毫升为单位）。
将鼻咽样品铺在补充有每毫升庆大霉素三微克的琼脂平板上，以选择肺炎链球菌的生长，同时抑制其他微生物的生长。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。对于流式细胞术，向含有肺样品的24孔板的每个孔中加入500微升消化缓冲液。
将培养皿孵育45分钟至1小时。接下来，使用P-1000微量移液器移动消化的肺并将它们放在过滤器上。然后使用三毫升注射器的柱塞捣碎样品。
接种的肺炎链球菌生物膜生长导致肺炎球菌携带受限于鼻咽部，同时避免系统性传播。肺炎链球菌IAV合并感染小鼠的疾病表现取决于细菌菌株。虽然肺炎链球菌、TIGR4 和 D39 的任何菌株中鼻咽细菌数量没有显着差异，但在 IAV 感染后 48 小时内，EF3030 播散到肺部没有显着差异。
感染肺炎链球菌TIGR4的小鼠中有40%显示出细菌向肺部的传播，其中一半成为菌血症。感染肺炎链球菌D39的小鼠显示100%扩散到肺部，其中一半经历了菌血症。在跟踪总生存期时，无论细菌菌株如何，合并感染小鼠的存活率均明显低于单独使用肺炎链球菌的小鼠。
该模型还用于评估IAV感染后肺部各种免疫细胞的存在。细菌菌株D39和TIGR4在从循环中引入的炎性免疫细胞（如中性粒细胞和单核细胞）中引起高于基线的显着增加，而EF3030则没有。 仅IAV感染就引起了免疫细胞（如NK细胞和γδT细胞）流入的基线以上的显着增加。
在病毒攻击之前鼻内感染肺炎链球菌的小鼠中，这些抗病毒反应显着减弱。在单次感染的小鼠中，年轻和老年队列之间的病毒滴度没有变化。老年小鼠表现出更早和更严重的疾病迹象，并且在24小时内死亡得更快，而年轻的对照组在感染中存活得更好。
将携带和疾病分成不同的步骤，使我们能够检查免疫反应以及在疾病进展的不同阶段重要的细菌和/或病毒因素。我们希望该模型将被其他实验室采用，以研究疾病进展不同阶段和各种宿主期间的其他多种微生物相互作用和宿主病原体相互作用。
