שיטה זו מתארת מודל עכברי חדש לחקר המעבר של פנאומוקוק ממתיישב אסימפטומטי לפתוגן גורם מחלה במהלך זיהום ויראלי. הוא מחקה בצורה קרובה יותר את מה שקורה אצל בני אדם. מודל זה יכול להיות כלי חשוב לזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות נגד דלקת ריאות פנאומוקוקית משנית אצל מארחים רגישים.
מודל זה משחזר את רגישות ההזדקנות. לכן, ניתן להשתמש בו כדי להבין אילו היבטים של המארח הופכים פגומים עם הגיל ולאפשר לנו להתאים אפשרויות טיפול למארחים קשישים פגיעים. גידול ביופילם פנאומוקוקי הוא מאתגר מכיוון שהזנים השונים לוקחים פרקי זמן שונים.
העצה שלי היא לנסות לגדל את הביופילם לפני ביצוע המחקר בבעלי חיים. ברגע שתאי H292 נפגשים ב-100%, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן להוסיף 250 מיקרוליטר של 4% paraformaldehyde לכל באר כדי לתקן את התאים לדגור במשך שעה אחת על קרח או לילה בארבע מעלות צלזיוס.
סטרק סטרפטוקוקוס דלקת ריאות זן של עניין על צלחת אגר הדם לדגור במשך הלילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. למחרת לחסן את החיידקים מהצלחת לתוך מדיה טרייה, מוגדרת כימית או CDM בתוספת אוקסיראז על ידי שטיפת החיידקים מהצלחת על ידי הוספת מיליליטר אחד של CDM בתוספת אוקסיראז ובעדינות להרים את מושבות החיידקים באמצעות הצד של קצה פיפטה של מיליליטר אחד, נזהר לא לגרד את האגר. לדלל את תרבית החיידקים ב- CDM בתוספת אוקסיראז ל- OD 600 התחלתי של 0.05.
לאחר מכן לגדל את החיידקים בצינור חרוטי 50 מיליליטר מכוסה באופן רופף ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עד OD של 0.2 הוא הגיע. לאחר מכן מערבלים את צינור תרבית החיידקים. זרעו 0.5 מיליליטר של התרבית על תאי H292 קבועים והוסיפו עוד 0.5 מיליליטר CDM בתוספת מדיום אוקסיאז לכל באר.
הוסף CDM בתוספת אוקסיראז לבארות הבקרה ללא חיידקים. דוגרים על הצלחת במשך 48 שעות בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. כל 12 שעות, לאחר הזריעה הראשונית, להחליף בעדינות את 0.5 מיליליטר של המדיום עם CDM טרי בתוספת Oxyrase.
היזהר לא לשבש את היווצרות של biofilm. בדוק את החלק התחתון של הצלחת עבור biofilm ולחפש עננות גוברת ככל שהזמן עובר עקב צמיחת biofilm. לאחר 48 שעות, להסיר את supernatant ולשטוף את biofilm פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS.
לאחר מכן השהה מחדש את הביופילם במיליליטר אחד של CDM טרי ופיפטה מעלה ומטה במרץ כדי להרים את הביופילם. עבור כל זן חיידקי, אגרו את התרבית מכל הבארות לצינור של 50 מיליליטר. יש לערבב היטב על ידי הטייה עדינה של הצינור הסגור היטב מעלה ומטה מספר פעמים.
לאחר מכן, הוסף 40% גליצרול ו- CDM בנפחים שווים כדי להשיג תרחיף חיידקי עם ריכוז סופי של 20% גליצרול. יש להכניס מיליליטר אחד לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה, להקפיא במהירות הבזק על קרח יבש ולחסוך במינוס 80 מעלות צלזיוס. הפשירו את הביופילם שגדל על קרח והסתובבו ב -1, 700 גרם במשך חמש דקות.
בזהירות להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע את הכדור. לאחר מכן שטפו את הגלולה על ידי השעייתה מחדש במיליליטר אחד של PBS וסובבו אותה שוב. מוציאים את הסופרנאטנט ומשהים מחדש את הגלולה בנפח הדרוש כדי להגיע לריכוז הרצוי.
יש לחסן את עכבר ששת הזכרים השחור C57 תוך אפי עם חמש פעמים 10 למושבה השישית או CFU על ידי הזרמת חמישה מיקרוליטרים של האינוקולום המדולל לכל נריס. לאחר החיסון, להחזיק את העכבר בחוזקה, לייצב את הראש עד עוצמת הקול נשאף. לאחר הפשרת הנגיף, יש לדלל את הנגיף ב-PBS לריכוז הרצוי.
יש להניח חומר סיכה אופתלמי על עיני העכבר לפני ההרדמה. הדביקו מיד את העכבר המורדם ב-50 מיקרוליטר של 20 יחידות יוצרות פלאק, או PFU, של נגיף שפעת A או IAV תוך קנה הנשימה באמצעות פינצטה קהה כדי למשוך את הלשון מהפה ולהעביר את נפח הנוזל במורד קנה הנשימה. לאחר ההחלמה, יש לחסן תוך אפית 10 מיקרוליטר של 200 PFU של IAV בשיטת החיסון שתוארה קודם לכן.
לאיסוף ריאות, באמצעות מספריים דיסקציה, לחתוך את הצדדים של כלוב הצלעות החשוף ולמשוך בעדינות את הצלעות כלפי מעלה לכיוון ראש העכבר כדי לחשוף את הלב. הכנס מחט 25 מד המחוברת למזרק 10 מיליליטר ממולא מראש עם PBS לחדר הימני והתחל לבלבל לאט. חפש הלבנה של הריאות כאינדיקטור של זילוח מוצלח.
יש לשטוף באיטיות כדי למנוע שבירת רקמת הריאה. להרים את הלב עם מלקחיים ולעשות חתך כדי להפריד את הריאות ואת הלב. לאחר ההפרדה, להרים את כל האונות של הריאה עם מלקחיים ולשטוף בצלחת עם PBS סטרילי כדי להסיר כל שאריות דם.
בצלחת פטרי, טוחנים את הריאה לחתיכות קטנות ומערבבים היטב. הסר מחצית מתערובת הריאות כדי לקבוע את ה- CFU החיידקי או ה- PFU הנגיפי והניחו אותו בצינור תחתון עגול של 15 מיליליטר ממולא מראש ב- 0.5 מיליליטר PBS לצורך הומוגניזציה. הסר את החצי השני של הריאה עבור ציטומטריית זרימה ומקם אותו בתרבית שאינה רקמה מטופלת צלחת 24 באר עם כל באר מלאה מראש עם 0.5 מיליליטר של RP10.
יש להשאיר בטמפרטורת החדר עד לעיבוד. כדי ליצור הומוגניזציה של הרקמה שנאספה נקו את בדיקת ההומוגנייזר על ידי הכנסתו לאתנול 70% והפעלת ההומוגנייזר בעוצמה של 60% למשך 30 שניות. חזור על שלב זה במים סטריליים למשך 10 שניות.
הומוגניזציה של כל רקמה למשך דקה אחת. לספירת מספרי חיידקים, דילול סדרתי של צלחות על צלחות אגר דם. כדי לחשב את סך CFU להשתמש 10 מיקרוליטר כדי צלחת ולציין את נפח הסופי מיליליטר עבור כל דגימה.
צלחת דגימות nasopharynx על צלחות אגר דם בתוספת שלושה מיקרוגרם למיליליטר gentamycin כדי לבחור את הצמיחה של דלקת ריאות S תוך עיכוב הצמיחה של מיקרואורגניזמים אחרים. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. עבור ציטומטריית זרימה, הוסף 500 מיקרוליטר של חיץ עיכול לכל באר של צלחת 24 בארות המכילה דגימת ריאה.
דוגרים על הצלחת במשך 45 דקות עד שעה. לאחר מכן, באמצעות פיפטה מיקרו P-1000, להזיז את הריאות מעוכלות ולהניח אותם על המסנן. לאחר מכן השתמש בבוכנה של מזרק שלושה מיליליטר כדי לרסק את המדגם.
צמיחת ביופילם S.pneumoniae inoculum גורמת להובלה עקבית של פנאומוקוק המוגבלת לאף ולוע תוך הימנעות מהתפשטות שיטתית. הצגת המחלה בעכברים נגועים ב- S pneumoniae IAV הייתה תלויה בזן החיידקי. אמנם לא היה הבדל משמעותי במספר החיידקים של הלוע בין אף אחד מהזנים, S pneumoniae, TIGR4 ו-D39, אך לא EF3030 הופצו לריאות עד 48 שעות לאחר ההדבקה ב-IAV.
40% מהעכברים שנדבקו בדלקת ריאות מסוג S TIGR4 הראו הפצת חיידקים לריאות ומתוכם מחצית הפכו לחיידקים. עכברים שנדבקו בדלקת ריאות מסוג S D39 הראו תפוצה של 100% לריאות ומחצית מהחיידק שחווה. במעקב אחר ההישרדות הכוללת, ללא קשר לזן החיידקי, שיעור ההישרדות של עכברים נגועים היה נמוך משמעותית מהעכברים שאותגרו עם דלקת ריאות S.
מודל זה שימש גם להערכת נוכחותם של תאי חיסון שונים בריאות לאחר זיהום IAV. זני החיידקים D39 ו-TIGR4 גרמו לעלייה משמעותית מעבר לקו הבסיס בזרם תאי מערכת החיסון הדלקתיים ממחזור הדם, כגון נויטרופילים ומונוציטים, בעוד ש-EF3030 לא. זיהום IAV לבדו גרם לעלייה משמעותית מעבר לקו הבסיס בזרם תאי החיסון כגון תאי NK ותאי T מסוג גמא דלתא.
תגובות אנטי-ויראליות אלה הופחתו באופן משמעותי בעכברים שנדבקו בדלקת ריאות מסוג S לפני האתגר הנגיפי. בעכברים שנדבקו ביחידות, הטיטרים הנגיפיים לא השתנו בין הקבוצות הצעירות והמבוגרות. עכברים זקנים הראו סימני מחלה מוקדמים יותר וחמורים יותר באופן משמעותי ומתו מהר יותר, תוך 24 שעות, בעוד שקבוצת הביקורת הצעירה שרדה את הזיהום טוב יותר.
הפרדת ההובלה והמחלה לשלבים נפרדים מאפשרת לנו לבחון הן את התגובה החיסונית והן את הגורמים החיידקיים או הנגיפיים החשובים בשלבים שונים של התקדמות המחלה. אנו מקווים שמודל זה יותאם על ידי מעבדות אחרות לחקר אינטראקציות פולימיקרוביאליות אחרות ואינטראקציות פתוגן של מארח במהלך שלבים שונים של התקדמות המחלה ועל פני המארחים השונים.
