この方法は、ウイルス感染中の無症候性コロニーナイザーから病気の原因となる病原体への肺炎球菌の移行を研究するための新しいマウスモデルを記載する。それは人間で起こることをより厳密に模倣します。このモデルは、感受性宿主における二次性肺炎球菌性肺炎に対する潜在的な治療標的を特定するための重要なツールとなり得る。
老化の影響を受けやすいモデルです。したがって、これは、宿主のどの側面が年齢とともに欠陥になるかを理解し、脆弱な高齢宿主の治療オプションを調整するために使用できます。肺炎球菌バイオフィルムの成長は、異なる株が異なる時間を要するため、困難です。
私のアドバイスは、動物実験を実行する前にバイオフィルムを成長させることです。H292細胞が100%コンフルエントになったら、PBSで細胞を3回洗浄します。次に、ウェルあたり250マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドを加えて細胞を固定し、氷上で1時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。
目的の肺炎連鎖球菌株を血液寒天プレートにストレーキし、摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。翌日、寒天をこすらないように注意しながら、1ミリリットルのCDMとオキシラーゼを加えてプレートから細菌を洗い流し、1ミリリットルのピペットチップの側面を使用して細菌コロニーを静かに持ち上げることにより、プレートから細菌を化学的に定義された新鮮な培地またはCDMとオキシラーゼに接種します。CDMとオキシラーゼの細菌培養物を0.05の開始OD 600に希釈します。
次に、緩く蓋をした50ミリリットルの円錐管で、摂氏37度と5%二酸化炭素で、OD0.2に達するまで細菌を増殖させます。次に細菌培養チューブをボルテックスする。固定H292細胞に0.5ミリリットルの培養物を播種し、ウェルあたりさらに0.5ミリリットルのCDMとオキシラーゼ培地を加えます。
CDMとオキシラーゼをバクテリアのないコントロールウェルに追加します。プレートを摂氏34度と5%二酸化炭素で48時間インキュベートします。最初の播種後、12時間ごとに、0.5ミリリットルの培地を新鮮なCDMとオキシラーゼと穏やかに交換します。
バイオフィルムの形成を妨げないように注意してください。プレートの底にバイオフィルムがないか確認し、バイオフィルムの成長により時間が経つにつれて曇りが増すのを探します。48時間後、上清を取り除き、1ミリリットルのPBSでバイオフィルムを2回洗浄する。
次に、バイオフィルムを1ミリリットルの新鮮なCDMに再懸濁し、ピペットで激しく上下させてバイオフィルムを持ち上げます。細菌株ごとに、すべてのウェルからの培養物を50ミリリットルのチューブにプールします。しっかりと蓋をしたチューブを数回上下にそっと傾けてよく混ぜます。
次に、40%グリセロールとCDMを等量添加して、最終濃度20%グリセロールの細菌懸濁液を実現します。1ミリリットルをマイクロ遠心チューブに分注し、ドライアイスで瞬間凍結し、摂氏マイナス80度で保存します。氷上でアリコートを成長させたバイオフィルムを解凍し、1, 700 Gで5分間回転させます。
ペレットを乱すことなく上清を慎重に取り除き、廃棄します。次に、ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁して洗浄し、再度回転させます。上清を除去し、所望の濃度に達するのに必要な量でペレットを再懸濁する。
5マイクロリットルの希釈接種材料を各ナリスにピペッティングすることにより、C57ブラック6匹のオスマウスを鼻腔内に接種し、10〜6番目のコロニー形成単位またはCFUを5回投与する。接種後、マウスをしっかりと持ち、容量が吸入されるまで頭を安定させます。ウイルスが解凍したら、PBSでウイルスを希望の濃度に希釈します。
麻酔の前にマウスの目に眼科用潤滑剤を置きます。麻酔をかけたマウスに、鈍いピンセットを使用して舌を口から引き出し、気管に大量の液体をピペッティングすることにより、50マイクロリットルの20個のプラーク形成ユニット(PFU)のインフルエンザAウイルスまたはIAVを気管内に感染させます。回復後、前述の接種方法を用いてIAVの200PFUを10マイクロリットル鼻腔内接種する。
肺の採取では、解剖ハサミを使用して、露出した胸郭の側面を切り、肋骨をマウスの頭に向かってゆっくりと引き上げて心臓を露出させます。PBSを事前に充填した25ミリリットルの注射器に取り付けられた10ゲージの針を右心室に挿入し、ゆっくりと灌流を開始します。灌流の成功の指標として肺の漂白を探します。
肺組織を壊さないようにゆっくりと洗い流してください。鉗子で心臓を持ち上げ、肺と心臓を分離するために切り込みを入れます。分離したら、鉗子で肺のすべての葉を拾い上げ、滅菌PBSを含む皿ですすぎ、残留血液を取り除きます。
ペトリ皿で、肺を細かく刻み、よく混ぜます。肺ミックスの半分を取り除き、細菌CFUまたはウイルスPFUを決定し、均質化のために0.5ミリリットルのPBSを事前に充填した丸底15ミリリットルのチューブに入れます。フローサイトメトリーのために肺の残りの半分を取り除き、各ウェルに0.5ミリリットルのRP10を予め充填した非組織培養処理24ウェルプレートに入れます。
処理するまで室温で放置してください。採取した組織を均質化するには、ホモジナイザープローブを70%エタノールに入れ、ホモジナイザーを60%電源で30秒間オンにして清掃します。滅菌水中でこの手順を10秒間繰り返します。
各組織を1分間均質化します。細菌数の列挙のために、血液寒天プレート上のプレート段階希釈。総CFUを計算するには、10マイクロリットルを使用してプレートし、各サンプルの最終容量をミリリットル単位で記録します。
鼻咽頭サンプルを、ミリリットルあたり3マイクログラムのゲンタマイシンを添加した血液寒天プレートにプレートし、他の微生物の増殖を抑制しながら肺炎球菌の増殖を選択します。摂氏37度と5%の二酸化炭素で一晩インキュベートします。フローサイトメトリーでは、肺サンプルを含む24ウェルプレートの各ウェルに500マイクロリットルの消化バッファーを追加します。
プレートを45分から1時間インキュベートします。次に、P-1000マイクロピペットを使用して、消化された肺を動かしてフィルターの上に置きます。次に、3ミリリットルのシリンジのプランジャーを使用してサンプルをマッシュします。
バイオフィルムの成長 S.pneumoniae 接種材料は、体系的な広がりを避けながら、鼻咽頭に限定された一貫した肺炎球菌キャリッジをもたらします。S肺炎IAV重感染マウスにおける疾患発現は、細菌株に依存していた。鼻咽頭の細菌数にはいずれの株間でも有意差はなかったが、肺炎球菌、TIGR4、D39は、IAV感染後48時間までに肺に播種したEF3030はなかった。
肺炎球菌TIGR4に感染したマウスの40%が肺への細菌の播種を示し、そのうちの半分がバクテレミックになりました。肺炎S.D39に感染したマウスは、肺への100%の播種を示し、その半分は菌血症を経験しました。全生存期間の追跡において、細菌株に関係なく、同時感染マウスの生存率は、肺炎球菌に単独で挑戦したマウスよりも有意に低かった。
このモデルは、IAV感染後の肺における様々な免疫細胞の存在を評価するためにも使用された。細菌株D39およびTIGR4は、好中球および単球などの循環からの炎症性免疫細胞の流入においてベースラインを超える有意な増加を誘発したが、EF3030は誘発しなかった。 IAV感染単独では、NK細胞およびガンマデルタT細胞などの免疫細胞の流入においてベースライン以上の有意な増加を誘発した。
これらの抗ウイルス反応は、ウイルスチャレンジの前に肺炎球菌に鼻腔内に感染したマウスで有意に鈍化しました。単一感染マウスでは、ウイルス力価は若年コホートと高齢コホートの間で変化しなかった。老齢マウスは、より早く、より重篤な疾患の兆候を示し、24時間以内により早く死亡したが、若い対照群は感染をよりよく生き延びた。
キャリッジと疾患を別々のステップに分けることで、免疫応答と、疾患進行のさまざまな段階で重要な細菌および/またはウイルス因子の両方を調べることができます。このモデルが他の研究室によって適応され、疾患の進行のさまざまな段階およびさまざまな宿主にわたる他のポリ微生物相互作用および宿主病原体相互作用を研究することを願っています。
