Bu yöntem, viral enfeksiyon sırasında pnömokokların asemptomatik bir kolonizörden hastalığa neden olan bir patojene geçişini incelemek için yeni bir fare modelini açıklamaktadır. İnsanlarda olanları daha yakından taklit eder. Bu model, duyarlı konakçılarda sekonder pnömokok pnömonisine karşı potansiyel terapötik hedefleri belirlemek için önemli bir araç olabilir.
Bu model yaşlanmanın duyarlılığını yeniden üretir. Bu nedenle, konakçının hangi yönlerinin yaşla birlikte kusurlu hale geldiğini anlamak ve savunmasız yaşlı konakçılar için tedavi seçeneklerini uyarlamamıza izin vermek için kullanılabilir. Büyüyen pnömokok biyofilmi zordur, çünkü farklı suşlar farklı miktarlarda zaman alır.
Benim tavsiyem, hayvan çalışmasını yürütmeden önce biyofilmi büyütmeyi denemektir. H292 hücreleri% 100 birleştiğinde, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra hücreleri sabitlemek için kuyucuk başına 250 mikrolitre% 4 paraformaldehit ekleyin ve buz üzerinde bir saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Strake streptococcus pneumoniae, kan agar plakasına ilgi duşu ve gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edilir. Ertesi gün, bir mililitre CDM artı Oxyrase ekleyerek bakterileri plakadan yıkayarak ve bir mililitrelik pipet ucunun kenarını kullanarak bakteri kolonilerini yavaşça kaldırarak, agar'ı kazımamaya dikkat ederek, bakterileri plakadan taze, kimyasal olarak tanımlanmış ortama veya CDM artı Oxyrase'ye aşılayın. CDM artı Oksiraz'daki bakteri kültürünü 0.05'lik bir başlangıç OD 600'üne seyreltin.
Daha sonra bakterileri, 0.2 OD'ye ulaşana kadar 37 santigrat derecede gevşek bir şekilde kapatılmış 50 mililitrelik konik tüpte ve% 5 karbondioksitte büyütün. Daha sonra bakteri kültürü tüpünü vorteks. Sabit H292 hücrelerine 0.5 mililitre kültür tohumlayın ve kuyucuk başına 0.5 mililitre CDM artı Oksiraz ortamı ekleyin.
Bakteri içermeyen kontrol kuyularına CDM artı Oxyrase ekleyin. Plakayı 34 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 48 saat boyunca inkübe edin. Her 12 saatte bir, ilk tohumlamayı takiben, ortamın 0.5 mililitresini taze CDM artı Oksiraz ile yavaşça değiştirin.
Biyofilm oluşumunu bozmamaya dikkat edin. Biyofilm için plakanın altını kontrol edin ve biyofilm büyümesi nedeniyle zaman geçtikçe artan bulanıklığa bakın. 48 saat sonra, süpernatantı çıkarın ve biyofilmi bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın.
Daha sonra biyofilmi bir mililitre taze CDM içinde yeniden askıya alın ve biyofilmi kaldırmak için pipeti kuvvetlice yukarı ve aşağı doğru çekin. Her bakteri suşu için, kültürü tüm kuyucuklardan 50 mililitrelik bir tüpe toplayın. Sıkıca kapatılmış tüpü birkaç kez yukarı ve aşağı doğru hafifçe eğerek iyice karıştırın.
Daha sonra,% 20 gliserol nihai konsantrasyonuna sahip bir bakteri süspansiyonu elde etmek için eşit hacimlerde% 40 gliserol ve CDM ekleyin. Bir mililitreyi bir mikro santrifüj tüpüne alın, kuru buzda dondurun ve eksi 80 santigrat derecede tasarruf edin. Yetiştirilen biyofilmi buz üzerinde çözün ve beş dakika boyunca 1.700 G'de döndürün.
Pelet bozmadan süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın. Daha sonra peleti bir mililitre PBS'de tekrar askıya alarak yıkayın ve tekrar döndürün. Süpernatantı çıkarın ve peleti istenen konsantrasyona ulaşmak için gereken hacimde yeniden askıya alın.
C57 siyah altı erkek fareyi, seyreltilmiş inokulumun beş mikrolitresini her bir narisin içine pipetleyerek beş kez 10 ila altıncı koloni oluşturan birimler veya CFU ile intranazal olarak aşılayın. Aşılamadan sonra, fareyi sıkıca tutun ve ses solunana kadar kafayı stabilize edin. Virüs çözüldükten sonra, PBS'deki virüsü istenen konsantrasyona seyreltin.
Anesteziden önce oftalmik kayganlaştırıcıyı farenin gözlerine yerleştirin. Anestezi uygulanan fareye, dili ağızdan çıkarmak için künt cımbız kullanarak ve sıvı hacmini trakeadan aşağı pipetlemek suretiyle intratrakeal olarak 50 mikrolitre 20 plak oluşturan ünite veya PFU, influenza A virüsü veya IAV ile hemen enfekte edin. İyileşmeyi takiben, daha önce tarif edilen aşılama yöntemini kullanarak intranazal olarak 10 mikrolitre 200 PFU IAV aşılayın.
Akciğer toplanması için, diseksiyon makası kullanarak, açıkta kalan göğüs kafesinin kenarlarını kesin ve kalbi açığa çıkarmak için kaburgaları yavaşça farenin başına doğru çekin. PBS ile önceden doldurulmuş 10 mililitrelik bir şırıngaya tutturulmuş 25 gauge iğneyi sağ ventriküle yerleştirin ve yavaşça karıştırmaya başlayın. Başarılı perfüzyonun bir göstergesi olarak akciğerlerin ağartılmasını arayın.
Akciğer dokusunun kırılmasını önlemek için yavaşça yıkayın. Kalbi forseps ile kaldırın ve akciğerleri ve kalbi ayırmak için bir kesim yapın. Ayrıldıktan sonra, akciğerin tüm loblarını forseps ile toplayın ve kalan kanı çıkarmak için steril PBS'li bir tabakta durulayın.
Bir Petri kabında, akciğeri küçük parçalara ayırın ve iyice karıştırın. Bakteriyel CFU veya viral PFU'yu belirlemek için akciğer karışımının yarısını çıkarın ve homojenizasyon için 0,5 mililitre PBS ile önceden doldurulmuş yuvarlak tabanlı 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Akciğerin diğer yarısını akış sitometrisi için çıkarın ve her biri 0.5 mililitre RP10 ile önceden doldurulmuş 24 delikli doku kültürü olmayan bir plakaya yerleştirin.
İşleme girene kadar oda sıcaklığında bırakın. Toplanan dokuyu homojenize etmek için, homojenizatör probunu %70 etanol içine koyarak ve homojenizatörü %60 güçte 30 saniye boyunca açarak temizleyin. Bu adımı steril suda 10 saniye boyunca tekrarlayın.
Her dokuyu bir dakika boyunca homojenize edin. Bakteri sayılarının sayımı için, kan agar plakalarındaki plaka seri seyreltmeleri. Toplam CFU'yu hesaplamak için, plaka için 10 mikrolitre kullanın ve her numune için mililitre cinsinden son hacmi not edin.
Nazofarenks örneklerini, diğer mikroorganizmaların büyümesini inhibe ederken S pneumoniae'nin büyümesini seçmek için mililitre gentamisin başına üç mikrogram ile desteklenmiş kan agar plakaları üzerine plakalayın. Gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Akış sitometrisi için, bir akciğer örneği içeren 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 500 mikrolitre sindirim tamponu ekleyin.
Plakayı 45 dakika ila bir saat arasında inkübe edin. Daha sonra, bir P-1000 mikro pipet kullanarak, sindirilmiş akciğerleri hareket ettirin ve filtreye yerleştirin. Ardından, numuneyi ezmek için üç mililitrelik bir şırınganın pistonunu kullanın.
Biyofilm büyümesi S.pneumoniae inoculum, sistematik yayılmayı önlerken nazofarenks ile sınırlı tutarlı pnömokok taşıyıcılığı ile sonuçlanır. S pneumoniae IAV koinfenfekte farelerde hastalık prezentasyonu bakteri suşuna bağlıydı. Herhangi bir suş arasında nazofarenksin bakteri sayılarında anlamlı bir fark bulunmamakla birlikte, S pneumoniae, TIGR4 ve D39, ancak EF3030, IAV enfeksiyonundan 48 saat sonra akciğerlere yayılmamıştır.
S pneumoniae TIGR4 ile enfekte olan farelerin% 40'ı akciğerlere bakteriyel yayılım gösterdi ve bunların yarısı bakterisemik hale geldi. S pneumoniae D39 ile enfekte olmuş fareler, akciğerlere% 100 yayılma gösterdi ve bu bakteriyeminin yarısı yaşandı. Genel sağkalımın izlenmesinde, bakteri suşundan bağımsız olarak, koenfekte olmuş farelerin hayatta kalma oranı, S pnömonisi ile tek başına meydan okuyan farelerden önemli ölçüde daha düşüktü.
Bu model aynı zamanda IAV enfeksiyonunu takiben akciğerlerde çeşitli bağışıklık hücrelerinin varlığını değerlendirmek için de kullanılmıştır. Bakteri suşları D39 ve TIGR4, nötrofiller ve monositler gibi dolaşımdan enflamatuar bağışıklık hücrelerinin akışında taban çizgisinin üzerinde önemli bir artış sağlarken, EF3030 bunu yapmadı. IAV enfeksiyonu tek başına, NK hücreleri ve gama delta T-hücreleri gibi bağışıklık hücrelerinin akışında taban çizgisinin üzerinde önemli bir artışa neden oldu.
Bu antiviral yanıtlar, viral meydan okumadan önce intranazal olarak S pneumoniae ile enfekte olmuş farelerde önemli ölçüde körelmiştir. Tek başına enfekte olmuş farelerde, viral titreler genç ve yaşlı kohortlar arasında değişmedi. Yaşlı fareler daha erken ve önemli ölçüde daha şiddetli hastalık belirtileri gösterdi ve 24 saat içinde daha hızlı öldü, oysa genç kontroller enfeksiyondan daha iyi kurtuldu.
Taşıma ve hastalığı farklı adımlara ayırmak, hem bağışıklık tepkisini hem de hastalığın ilerlemesinin farklı aşamalarında önemli olan bakteriyel ve veya viral faktörleri incelememizi sağlar. Bu modelin, hastalığın ilerlemesinin farklı aşamalarında ve çeşitli konakçılarda diğer polimikrobiyal etkileşimleri ve konakçı patojen etkileşimlerini incelemek için diğer laboratuvarlar tarafından uyarlanacağını umuyoruz.
