Questo metodo descrive un nuovo modello murino per studiare la transizione dello pneumococco da un colonizzatore asintomatico a un agente patogeno che causa la malattia durante l'infezione virale. Imita più da vicino ciò che accade negli esseri umani. Questo modello può essere uno strumento importante per identificare potenziali bersagli terapeutici contro la polmonite da pneumococco secondaria in ospiti sensibili.
Questo modello riproduce la suscettibilità dell'invecchiamento. Pertanto, può essere utilizzato per capire quali aspetti dell'ospite diventano difettosi con l'età e consentirci di personalizzare le opzioni di trattamento per gli ospiti anziani vulnerabili. La crescita del biofilm pneumococcico è impegnativa poiché i diversi ceppi richiedono diverse quantità di tempo.
Il mio consiglio è di provare a coltivare il biofilm prima di eseguire lo studio sugli animali. Una volta che le cellule H292 sono confluenti al 100%, lavare le cellule tre volte con PBS. Quindi aggiungere 250 microlitri di paraformaldeide al 4% per pozzetto per fissare le cellule e incubare per un'ora sul ghiaccio o durante la notte a quattro gradi Celsius.
Strake streptococcus pneumoniae ceppo di interesse sulla piastra di agar sangue e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo inoculare i batteri dalla piastra in mezzi freschi, chimicamente definiti o CDM più ossirasi lavando i batteri dalla piastra aggiungendo un millilitro di CDM più ossirasi e sollevando delicatamente le colonie batteriche usando il lato di una punta di pipetta da un millilitro, facendo attenzione a non raschiare l'agar. Diluire la coltura batterica in CDM più Ossirasi a un OD 600 iniziale di 0,05.
Quindi far crescere i batteri in un tubo conico da 50 millilitri con tappo libero a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica fino a raggiungere OD di 0,2. Prossimo vortice il tubo di coltura batterica. Seminare 0,5 millilitri della coltura sulle cellule H292 fisse e aggiungere altri 0,5 millilitri di CDM più mezzo di ossirasi per pozzetto.
Aggiungi CDM più Oxyrase ai pozzetti di controllo senza batteri. Incubare la piastra per 48 ore a 34 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Ogni 12 ore, dopo la semina iniziale, sostituire delicatamente gli 0,5 millilitri del terreno con CDM fresco più Ossarasi.
Fare attenzione a non interrompere la formazione del biofilm. Controlla la parte inferiore della piastra per il biofilm e cerca l'aumento della nuvolosità con il passare del tempo a causa della crescita del biofilm. Dopo 48 ore, rimuovere il surnatante e lavare il biofilm due volte con un millilitro di PBS.
Quindi risospendere il biofilm in un millilitro di CDM fresco e pipettare su e giù vigorosamente per sollevare il biofilm. Per ogni ceppo batterico, raggruppare la coltura da tutti i pozzetti in un tubo da 50 millilitri. Mescolare bene inclinando delicatamente il tubo strettamente tappato su e giù più volte.
Quindi, aggiungere il 40% di glicerolo e CDM a volumi uguali per ottenere una sospensione batterica con una concentrazione finale del 20% di glicerolo. Aliquot un millilitro in una provetta da micro centrifuga, congelare il flash su ghiaccio secco e risparmiare a meno 80 gradi Celsius. Scongelare le aliquote coltivate sul ghiaccio e centrifugare a 1.700 G per cinque minuti.
Rimuovere con attenzione e scartare il surnatante senza interrompere il pellet. Quindi lavare il pellet risospendendolo in un millilitro di PBS e girarlo di nuovo. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet nel volume necessario per raggiungere la concentrazione desiderata.
Inoculare il topo nero C57 sei maschi per via intranasale con cinque volte 10 alla sesta colonia formando unità o CFU pipettando cinque microlitri di inoculo diluito in ciascun naris. Dopo l'inoculazione, tenere saldamente il mouse, stabilizzando la testa fino a quando il volume non viene inalato. Una volta che il virus si è scongelato, diluire il virus in PBS alla concentrazione desiderata.
Posizionare il lubrificante oftalmico sugli occhi del topo prima dell'anestesia. Infettare immediatamente il topo anestetizzato con 50 microlitri di 20 unità formanti placca, o PFU, del virus dell'influenza A o IAV per via intratracheale utilizzando pinzette smussate per estrarre la lingua dalla bocca e pipettare il volume di liquido lungo la trachea. Dopo il recupero, inoculare per via intranasale 10 microlitri di 200 PFU di IAV utilizzando il metodo di inoculazione descritto in precedenza.
Per la raccolta dei polmoni, usando le forbici da dissezione, tagliare i lati della gabbia toracica esposta e tirare delicatamente le costole verso la testa del topo per esporre il cuore. Inserire un ago da 25 gauge collegato a una siringa da 10 millilitri preriempita con PBS nel ventricolo destro e iniziare lentamente a perfondere. Cerca lo sbiancamento dei polmoni come indicatore di perfusione riuscita.
Sciacquare lentamente per evitare di rompere il tessuto polmonare. Sollevare il cuore con una pinza e fare un taglio per separare i polmoni e il cuore. Una volta separati, raccogliere tutti i lobi del polmone con una pinza e risciacquare in un piatto con PBS sterile per rimuovere eventuali residui di sangue.
In una capsula di Petri, tritare il polmone in piccoli pezzi e mescolare bene. Rimuovere metà della miscela polmonare per determinare il CFU batterico o PFU virale e posizionarlo in un tubo rotondo da 15 millilitri preriempito con 0,5 millilitri di PBS per l'omogeneizzazione. Rimuovere l'altra metà del polmone per la citometria a flusso e posizionarla in una piastra a 24 pozzetti trattata con coltura non tissutale con ciascun pozzetto preriempito con 0,5 millilitri di RP10.
Lasciare a temperatura ambiente fino alla lavorazione. Per omogeneizzare il tessuto raccolto, pulire la sonda omogeneizzatore mettendola in etanolo al 70% e accendendo l'omogeneizzatore al 60% di potenza per 30 secondi. Ripetere questo passaggio in acqua sterile per 10 secondi.
Omogeneizzare ogni tessuto per un minuto. Per l'enumerazione dei numeri batterici, diluizioni seriali della piastra su piastre di agar sangue. Per calcolare il CFU totale utilizzare 10 microlitri per placcare e annotare il volume finale in millilitri per ciascun campione.
Placcare i campioni di rinofaringe su piastre di agar di sangue integrate con tre microgrammi per millilitro di gentamicina per selezionare la crescita di S pneumoniae mentre inibisce la crescita di altri microrganismi. Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Per la citometria a flusso, aggiungere 500 microlitri di tampone di digestione a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente un campione polmonare.
Incubare il piatto per 45 minuti a un'ora. Quindi, utilizzando una micro pipetta P-1000, spostare i polmoni digeriti e posizionarli sul filtro. Quindi utilizzare lo stantuffo di una siringa da tre millilitri per schiacciare il campione.
L'inoculo di S.pneumoniae di crescita del biofilm determina un trasporto pneumococcico coerente limitato al rinofaringe evitando la diffusione sistematica. La presentazione della malattia nei topi coinfetti da S pneumoniae IAV dipendeva dal ceppo batterico. Mentre non c'era alcuna differenza significativa nel numero batterico del rinofaringe tra nessuno dei ceppi, S pneumoniae, TIGR4 e D39, ma non EF3030 disseminato ai polmoni entro 48 ore dopo l'infezione IAV.
Il 40% dei topi infettati da S pneumoniae TIGR4 ha mostrato disseminazione batterica ai polmoni e di questi, la metà di loro è diventata batterica. I topi infettati da S pneumoniae D39 hanno mostrato il 100% di disseminazione ai polmoni e metà di quelli hanno sperimentato batteriemia. Nel tracciare la sopravvivenza globale, indipendentemente dal ceppo batterico, il tasso di sopravvivenza dei topi coinfetti era significativamente inferiore rispetto ai topi singolarmente sfidati con S pneumoniae.
Questo modello è stato utilizzato anche per valutare la presenza di varie cellule immunitarie nei polmoni dopo l'infezione da IAV. I ceppi batterici D39 e TIGR4 hanno provocato un aumento significativo al di sopra del basale nell'afflusso di cellule immunitarie infiammatorie dalla circolazione, come neutrofili e monociti, mentre EF3030 no. L'infezione da IAV da sola ha suscitato un aumento significativo al di sopra del basale nell'afflusso di cellule immunitarie come le cellule NK e le cellule T gamma delta.
Queste risposte antivirali sono state significativamente attenuate nei topi infettati per via intranasale con S pneumoniae prima della sfida virale. Nei topi singolarmente infetti, i titoli virali non variavano tra le coorti giovani e anziane. I topi anziani hanno mostrato segni di malattia più precoci e significativamente più gravi e sono morti più velocemente, entro 24 ore, mentre i giovani controlli sono sopravvissuti meglio all'infezione.
Separare il trasporto e la malattia in fasi distinte ci consente di esaminare sia la risposta immunitaria che i fattori batterici e/o virali importanti nelle diverse fasi della progressione della malattia. Speriamo che questo modello venga adattato da altri laboratori per studiare altre interazioni polimicrobiche e interazioni patogene ospiti durante le diverse fasi della progressione della malattia e tra i vari ospiti.
