Este método descreve um novo modelo de camundongo para estudar a transição do pneumococo de um colonizador assintomático para um patógeno causador de doença durante a infecção viral. Ele imita mais de perto o que acontece em humanos. Esse modelo pode ser uma ferramenta importante para identificar potenciais alvos terapêuticos contra a pneumonia pneumocócica secundária em hospedeiros suscetíveis.
Esse modelo reproduz a suscetibilidade do envelhecimento. Portanto, ele pode ser usado para entender quais aspectos do hospedeiro se tornam defeituosos com a idade e nos permite adaptar as opções de tratamento para hospedeiros idosos vulneráveis. O crescimento do biofilme pneumocócico é um desafio, uma vez que as diferentes cepas levam diferentes quantidades de tempo.
Meu conselho é tentar cultivar o biofilme antes de executar o estudo com animais. Uma vez que as células H292 são 100% confluentes, lave as células três vezes com PBS. Em seguida, adicione 250 microlitros de paraformaldeído a 4% por poço para fixar as células e incube por uma hora no gelo ou durante a noite a quatro graus Celsius.
Strake streptococcus pneumoniae cepa de interesse na placa de ágar sangue e incubar durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, inocular as bactérias da placa em meio fresco e quimicamente definido ou CDM mais Oxyrase, lavando as bactérias da placa adicionando um mililitro do MDL mais Oxyrase e levantando suavemente as colônias bacterianas usando o lado de uma ponta de pipeta de um mililitro, tomando cuidado para não raspar o ágar. Diluir a cultura bacteriana em MDL mais Oxirase para um OD inicial de 600 de 0,05.
Em seguida, cresça as bactérias em um tubo cônico de 50 mililitros frouxamente tampado a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até que OD de 0,2 seja alcançado. Em seguida, vórtice o tubo de cultura bacteriana. Semeando 0,5 mililitros da cultura nas células H292 fixas e adicionando mais 0,5 mililitros de MDL mais meio Oxyrase por poço.
Adicione MDL mais Oxyrase aos poços de controle sem bactérias. Incubar a placa durante 48 horas a 34 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. A cada 12 horas, após a semeadura inicial, substitua suavemente os 0,5 mililitros do meio por MDL fresco mais Oxirase.
Tenha cuidado para não atrapalhar a formação do biofilme. Verifique o fundo da placa para biofilme e procure aumentar a nebulosidade com o passar do tempo devido ao crescimento do biofilme. Após 48 horas, remova o sobrenadante e lave o biofilme duas vezes com um mililitro de PBS.
Em seguida, ressuspenda o biofilme em um mililitro de MDL fresco e pipete para cima e para baixo vigorosamente para levantar o biofilme. Para cada cepa bacteriana, agrupe a cultura de todos os poços em um tubo de 50 mililitros. Misture bem inclinando suavemente o tubo bem tampado para cima e para baixo várias vezes.
Em seguida, adicione 40% de glicerol e MDL em volumes iguais para obter uma suspensão bacteriana com uma concentração final de 20% de glicerol. Alíquota um mililitro em um tubo de microcentrífuga, congele rapidamente no gelo seco e economize a menos 80 graus Celsius. Descongele as alíquotas cultivadas no gelo e gire a 1.700 G por cinco minutos.
Retire e descarte cuidadosamente o sobrenadante sem interromper o pellet. Em seguida, lave o pellet ressuspendendo-o em um mililitro de PBS e gire-o novamente. Retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet no volume necessário para atingir a concentração desejada.
Inocular o camundongo C57 preto seis machos por via intranasal com cinco vezes 10 até a sexta colônia formando unidades ou UFC pipetando cinco microlitros do inóculo diluído em cada naris. Após a inoculação, segure o rato com firmeza, estabilizando a cabeça até que o volume seja inalado. Uma vez que o vírus tenha descongelado, dilua o vírus em PBS para a concentração desejada.
Coloque lubrificante oftálmico nos olhos do rato antes da anestesia. Infectar imediatamente o camundongo anestesiado com 50 microlitros de 20 unidades formadoras de placa, ou PFU, do vírus influenza A ou IAV intratraquealmente usando pinças rombas para puxar a língua para fora da boca e pipetando o volume de líquido pela traqueia. Após a recuperação, inocular intranasalmente 10 microlitros de 200 UFP de IAV usando o método de inoculação descrito anteriormente.
Para a coleta pulmonar, usando tesoura de dissecção, corte as laterais da caixa torácica exposta e puxe suavemente as costelas para cima em direção à cabeça do mouse para expor o coração. Insira uma agulha de calibre 25 acoplada a uma seringa de 10 mililitros pré-cheia com PBS no ventrículo direito e comece a perfundir lentamente. Procure clareamento dos pulmões como indicador de perfusão bem-sucedida.
Lave lentamente para evitar a quebra do tecido pulmonar. Levante o coração com pinças e faça um corte para separar os pulmões e o coração. Uma vez separado, pegue todos os lóbulos do pulmão com pinça e enxágue em um prato com PBS estéril para remover qualquer sangue residual.
Em uma placa de Petri, pique o pulmão em pedaços pequenos e misture bem. Remova metade da mistura pulmonar para determinar a UFC bacteriana ou a UFP viral e coloque-a em um tubo de fundo redondo de 15 mililitros pré-preenchido com 0,5 mililitros de PBS para homogeneização. Retirar a outra metade do pulmão para citometria de fluxo e colocá-lo em uma placa de 24 poços não tratada com cultura de tecidos com cada poço pré-preenchido com 0,5 mililitros de RP10.
Deixar à temperatura ambiente até ao processamento. Para homogeneizar o tecido coletado, limpe a sonda homogeneizadora, colocando-a em etanol 70% e ligando o homogeneizador a 60% de potência por 30 segundos. Repita este passo em água estéril durante 10 segundos.
Homogeneizar cada tecido por um minuto. Para enumeração dos números bacterianos, diluições seriadas em placas de ágar sangue. Para calcular o total de UFC use 10 microlitros para chapear e anotar o volume final em mililitros para cada amostra.
Plaquear as amostras de nasofaringe em placas de ágar sangue suplementadas com três microgramas por mililitro de gentamicina para selecionar o crescimento de S pneumoniae enquanto inibe o crescimento de outros microrganismos. Incubar durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para citometria de fluxo, adicione 500 microlitros de tampão de digestão a cada poço de uma placa de 24 poços contendo uma amostra de pulmão.
Incubar a placa por 45 minutos a uma hora. Em seguida, usando uma micropipeta P-1000, mova os pulmões digeridos e coloque-os no filtro. Em seguida, use o êmbolo de uma seringa de três mililitros para amassar a amostra.
O inóculo de crescimento de biofilme de S.pneumoniae resulta em carreamento pneumocócico consistente restrito à nasofaringe, evitando disseminação sistemática. A apresentação da doença em camundongos coinfectados com S pneumoniae IAV foi dependente da cepa bacteriana. Embora não tenha havido diferença significativa no número bacteriano da nasofaringe entre nenhuma das cepas, S pneumoniae, TIGR4 e D39, mas não EF3030 disseminaram-se para os pulmões até 48 horas após a infecção por IAV.
40% dos camundongos infectados com S pneumoniae TIGR4 apresentaram disseminação bacteriana para os pulmões e, destes, metade deles tornou-se bacterêmica. Camundongos infectados com S pneumoniae D39 apresentaram 100% de disseminação para os pulmões e metade disso apresentou bacteremia. No rastreamento da sobrevida global, independentemente da cepa bacteriana, a taxa de sobrevivência dos camundongos coinfectados foi significativamente menor do que os camundongos isolados desafiados com S pneumoniae.
Esse modelo também foi usado para avaliar a presença de várias células imunes nos pulmões após a infecção pelo IAV. As cepas bacterianas D39 e TIGR4 provocaram um aumento significativo acima da linha de base no influxo de células imunes inflamatórias da circulação, como neutrófilos e monócitos, enquanto EF3030 não.
Essas respostas antivirais foram significativamente embotadas em camundongos infectados intranasalmente com S pneumoniae antes do desafio viral. Em camundongos infectados, os títulos virais não variaram entre as coortes jovens e envelhecidas. Camundongos velhos apresentaram sinais mais precoces e significativamente mais graves da doença e morreram mais rápido, dentro de 24 horas, enquanto os controles jovens sobreviveram melhor à infecção.
Separar o carreamento e a doença em etapas distintas nos permite examinar tanto a resposta imune quanto os fatores bacterianos e/ou virais importantes em diferentes fases da progressão da doença. Esperamos que este modelo seja adaptado por outros laboratórios para estudar outras interações polimicrobianas e interações de patógenos hospedeiros durante diferentes fases de progressão da doença e entre os vários hospedeiros.
