Diese Methode beschreibt ein neues Mausmodell zur Untersuchung des Übergangs von Pneumokokken von einem asymptomatischen Kolonisator zu einem krankheitserregenden Erreger während einer Virusinfektion. Es ahmt genauer nach, was beim Menschen passiert. Dieses Modell kann ein wichtiges Werkzeug sein, um potenzielle therapeutische Ziele gegen die sekundäre Pneumokokken-Pneumonie in empfänglichen Wirten zu identifizieren.
Dieses Modell reproduziert die Anfälligkeit des Alterns. Daher kann es verwendet werden, um zu verstehen, welche Aspekte des Wirts mit zunehmendem Alter defekt werden, und es uns ermöglichen, maßgeschneiderte Behandlungsoptionen für gefährdete ältere Wirte zu entwickeln. Die Züchtung von Pneumokokken-Biofilmen ist eine Herausforderung, da die verschiedenen Stämme unterschiedlich lange brauchen.
Mein Rat ist, zu versuchen, den Biofilm zu züchten, bevor Sie die Tierstudie durchführen. Sobald die H292-Zellen zu 100 % konfluent sind, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Geben Sie dann 250 Mikroliter 4%Paraformaldehyd pro Well hinzu, um die Zellen zu fixieren, und inkubieren Sie sie eine Stunde lang auf Eis oder über Nacht bei vier Grad Celsius.
Streptococcus pneumoniae Stamm von Interesse auf Blutagarplatte legen und über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Beimpfen Sie am nächsten Tag die Bakterien von der Platte in frische, chemisch definierte Medien oder CDM plus Oxyrase, indem Sie die Bakterien von der Platte waschen, indem Sie einen Milliliter CDM plus Oxyrase hinzufügen und die Bakterienkolonien vorsichtig mit der Seite einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze anheben, wobei Sie darauf achten, dass der Agar nicht abgekratzt wird. Verdünnen Sie die Bakterienkultur in CDM plus Oxyrase auf eine Ausgangs-OD 600 von 0,05.
Dann züchten Sie die Bakterien in einem locker verschlossenen konischen 50-Milliliter-Röhrchen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bis ein OD von 0,2 erreicht ist. Als nächstes wird das Bakterienkulturröhrchen vorgewirbelt. Säen Sie 0,5 Milliliter der Kultur auf die fixierten H292-Zellen und fügen Sie weitere 0,5 Milliliter CDM plus Oxyrase-Medium pro Vertiefung hinzu.
Geben Sie CDM plus Oxyrase in die Kontrollvertiefungen ohne Bakterien. Inkubieren Sie die Platte 48 Stunden lang bei 34 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Ersetzen Sie alle 12 Stunden nach der ersten Aussaat vorsichtig die 0,5 Milliliter des Mediums durch frisches CDM plus Oxyrase.
Achten Sie darauf, die Bildung von Biofilm nicht zu stören. Überprüfen Sie die Unterseite der Platte auf Biofilm und achten Sie darauf, dass die Trübung im Laufe der Zeit aufgrund des Biofilmwachstums zunimmt. Entfernen Sie nach 48 Stunden den Überstand und waschen Sie den Biofilm zweimal mit einem Milliliter PBS.
Anschließend den Biofilm in einem Milliliter frischem CDM resuspendieren und kräftig auf und ab pipettieren, um den Biofilm anzuheben. Für jeden Bakterienstamm wird die Kultur aus allen Vertiefungen in ein 50-Milliliter-Röhrchen gefüllt. Mischen Sie gut, indem Sie das fest verschlossene Röhrchen mehrmals vorsichtig auf und ab kippen.
Als nächstes werden 40 % Glycerin und CDM in gleichen Mengen hinzugefügt, um eine bakterielle Suspension mit einer Endkonzentration von 20 % Glycerin zu erhalten. Einen Milliliter in ein Mikrozentrifugenröhrchen aliquotieren, auf Trockeneis schockgefrieren und bei minus 80 Grad Celsius aufbewahren. Tauen Sie die im Biofilm gewachsenen Aliquots auf Eis auf und schleudern Sie sie fünf Minuten lang bei 1.700 g.
Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu beschädigen. Waschen Sie dann das Pellet, indem Sie es in einem Milliliter PBS resuspendieren und erneut schleudern. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in dem Volumen, das zum Erreichen der gewünschten Konzentration erforderlich ist.
Inokulieren Sie die C57 black six männliche Maus intranasal mit fünf mal 10 bis sechsten koloniebildenden Einheiten oder KBE, indem fünf Mikroliter des verdünnten Inokulums in jede Naris pipettiert werden. Halten Sie die Maus nach der Inokulation fest und stabilisieren Sie den Kopf, bis das Volumen eingeatmet wird. Sobald das Virus aufgetaut ist, verdünnen Sie das Virus in PBS auf die gewünschte Konzentration.
Tragen Sie vor der Narkose ophthalmisches Gleitmittel auf die Augen der Maus auf. Infizieren Sie die anästhesierte Maus sofort intratracheal mit 50 Mikrolitern von 20 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) des Influenza-A-Virus oder IAV, indem Sie die Zunge mit einer stumpfen Pinzette aus dem Mund ziehen und das Flüssigkeitsvolumen in die Luftröhre pipettieren. Nach der Genesung werden 10 Mikroliter 200 PFU IAV mit der zuvor beschriebenen Impfmethode intranasal inokuliert.
Schneiden Sie für die Lungenentnahme mit einer Sezierschere die Seiten des freiliegenden Brustkorbs ab und ziehen Sie die Rippen vorsichtig nach oben in Richtung des Kopfes der Maus, um das Herz freizulegen. Führen Sie eine 25-Gauge-Nadel, die an einer mit PBS vorgefüllten 10-Milliliter-Spritze befestigt ist, in die rechte Herzkammer ein und beginnen Sie langsam mit der Perfurierung. Achten Sie auf eine Bleiche der Lunge als Indikator für eine erfolgreiche Durchblutung.
Spülen Sie langsam, um einen Bruch des Lungengewebes zu vermeiden. Heben Sie das Herz mit einer Pinzette an und machen Sie einen Schnitt, um Lunge und Herz zu trennen. Nehmen Sie nach der Trennung alle Lungenlappen mit einer Pinzette auf und spülen Sie sie in einer Schale mit sterilem PBS aus, um das restliche Blut zu entfernen.
In einer Petrischale die Lunge in kleine Stücke schneiden und gut vermischen. Entfernen Sie die Hälfte der Lungenmischung, um die bakterielle KBE oder das virale PFU zu bestimmen, und legen Sie sie zur Homogenisierung in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden, das mit 0,5 Millilitern PBS vorgefüllt ist. Entfernen Sie die andere Hälfte der Lunge für die Durchflusszytometrie und legen Sie sie in eine mit Nichtgewebekultur behandelte 24-Well-Platte, wobei jede Well mit 0,5 Millilitern RP10 vorgefüllt ist.
Bis zur Verarbeitung bei Raumtemperatur stehen lassen. Um das gesammelte Gewebe zu homogenisieren, reinigen Sie die Homogenisatorsonde, indem Sie sie in 70%iges Ethanol einlegen und den Homogenisator 30 Sekunden lang mit 60%iger Leistung einschalten. Wiederholen Sie diesen Schritt 10 Sekunden lang in sterilem Wasser.
Homogenisieren Sie jedes Gewebe eine Minute lang. Zur Zählung der Bakterienzahlen Plattenreihenverdünnungen auf Blutagarplatten. Um die Gesamtkbe zu berechnen, verwenden Sie 10 Mikroliter, um das endgültige Volumen in Millilitern für jede Probe zu dokumentieren und zu notieren.
Die Nasopharynx-Proben werden auf Blutagarplatten plattiert, die mit drei Mikrogramm Gentamycin pro Milliliter ergänzt werden, um das Wachstum von S-Pneumonien zu selektieren und gleichzeitig das Wachstum anderer Mikroorganismen zu hemmen. Über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Für die Durchflusszytometrie werden 500 Mikroliter Aufschlusspuffer in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte gegeben, die eine Lungenprobe enthält.
Inkubieren Sie die Platte 45 Minuten bis eine Stunde lang. Bewegen Sie als Nächstes mit einer P-1000-Mikropipette die verdaute Lunge und legen Sie sie auf den Filter. Verwenden Sie dann den Kolben einer Drei-Milliliter-Spritze, um die Probe zu zerdrücken.
Das Inokulum von S. pneumoniae führt zu einer gleichmäßigen Übertragung von Pneumokokken, die auf den Nasenrachenraum beschränkt ist, während eine systematische Ausbreitung vermieden wird. Das Krankheitsbild in S pneumoniae IAV koinfizierten Mäusen war abhängig vom Bakterienstamm. Während es bei keinem der Stämme einen signifikanten Unterschied in der Bakterienzahl des Nasopharynx gab, verbreiteten sich S pneumoniae, TIGR4 und D39, aber nicht EF3030 48 Stunden nach der IAV-Infektion in die Lunge.
40% der Mäuse, die mit S pneumoniae TIGR4 infiziert waren, zeigten eine bakterielle Ausbreitung in die Lunge, von denen die Hälfte bakteriämisch wurde. Mäuse, die mit S pneumoniae D39 infiziert waren, zeigten eine 100%ige Ausbreitung in die Lunge, und die Hälfte von ihnen erlitt eine Bakteriämie. Bei der Verfolgung des Gesamtüberlebens, unabhängig vom Bakterienstamm, war die Überlebensrate der koinfizierten Mäuse signifikant niedriger als die der Mäuse, die einzeln mit S-Pneumonien konfrontiert wurden.
Dieses Modell wurde auch verwendet, um das Vorhandensein verschiedener Immunzellen in der Lunge nach einer IAV-Infektion zu beurteilen. Die Bakterienstämme D39 und TIGR4 führten zu einem signifikanten Anstieg des Einstroms von entzündlichen Immunzellen wie Neutrophilen und Monozyten aus dem Blutkreislauf, während dies bei EF3030 nicht der Fall war. Die IAV-Infektion allein führte zu einem signifikanten Anstieg des Einstroms von Immunzellen wie NK-Zellen und Gamma-Delta-T-Zellen über den Ausgangswert.
Diese antiviralen Reaktionen waren bei Mäusen, die intranasal mit S-pneumonien infiziert waren, vor der viralen Provokation signifikant abgeschwächt. Bei einzeln infizierten Mäusen unterschieden sich die Virustiter nicht zwischen der jungen und der älteren Kohorte. Alte Mäuse zeigten früher und signifikant schwerere Krankheitssymptome und starben schneller, innerhalb von 24 Stunden, während die jungen Kontrollen die Infektion besser überlebten.
Die Aufteilung von Übertragung und Krankheit in verschiedene Schritte ermöglicht es uns, sowohl die Immunantwort als auch die bakteriellen und/oder viralen Faktoren zu untersuchen, die in verschiedenen Phasen des Krankheitsverlaufs wichtig sind. Wir hoffen, dass dieses Modell von anderen Laboren adaptiert wird, um andere polymikrobielle Interaktionen und Interaktionen zwischen Wirtserregern und Wirtserregern in verschiedenen Phasen des Krankheitsverlaufs und über die verschiedenen Wirte hinweg zu untersuchen.
