Этот метод описывает новую мышиную модель для изучения перехода пневмококка от бессимптомного колонизатора к болезнетворному патогену при вирусной инфекции. Он более точно имитирует то, что происходит у людей. Эта модель может быть важным инструментом для выявления потенциальных терапевтических мишеней против вторичной пневмококковой пневмонии у восприимчивых хозяев.
Эта модель воспроизводит восприимчивость к старению. Таким образом, его можно использовать, чтобы понять, какие аспекты хозяина становятся дефектными с возрастом, и позволить нам адаптировать варианты лечения для уязвимых пожилых хозяев. Выращивание пневмококковой биопленки является сложной задачей, поскольку разные штаммы занимают разное количество времени.
Я советую попробовать вырастить биопленку перед проведением исследования на животных. Как только ячейки H292 будут на 100% сливаться, трижды промойте клетки PBS. Затем добавьте 250 микролитров 4% параформальдегида на лунку, чтобы зафиксировать клетки, и инкубируйте в течение одного часа на льду или на ночь при четырех градусах Цельсия.
Штамм Streptococcus pneumoniae представляет интерес для анализа на пластине с кровяным агаром и инкубируется в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию и 5% углекислого газа. На следующий день инокулируйте бактерии с тарелки в свежую, химически определенную среду или CDM плюс оксиразу, смывая бактерии с тарелки, добавляя один миллилитр CDM плюс оксиразу и осторожно поднимая бактериальные колонии, используя сторону наконечника пипетки объемом в один миллилитр, стараясь не соскребать агар. Разбавьте бактериальную культуру в CDM плюс оксиразу до начального OD 600 0,05.
Затем выращивайте бактерии в неплотно закрытой конической трубке объемом 50 миллилитров при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа до тех пор, пока не будет достигнут OD 0,2. Затем вихревая бактериальная культуральная трубка. Засейте 0,5 миллилитра культуры на закрепленные клетки H292 и добавьте еще 0,5 миллилитра CDM плюс оксиразную среду на лунку.
Добавьте CDM плюс оксиразу в контрольные лунки без бактерий. Инкубируйте тарелку в течение 48 часов при температуре 34 градуса Цельсия и 5% углекислого газа. Каждые 12 часов, после первоначального посева, аккуратно заменяйте 0,5 миллилитра среды свежим CDM плюс оксиразой.
Будьте осторожны, чтобы не нарушить образование биопленки. Проверьте нижнюю часть пластины на наличие биопленки и обратите внимание на увеличение помутнения с течением времени из-за роста биопленки. Через 48 часов удалите надосадочную жидкость и дважды промойте биопленку одним миллилитром PBS.
Затем ресуспендируйте биопленку в одном миллилитре свежего CDM и энергично пипеткой вверх и вниз, чтобы поднять биопленку. Для каждого бактериального штамма соберите культуру из всех лунок в 50-миллилитровую пробирку. Хорошо перемешайте, осторожно наклонив плотно закрытую трубку вверх и вниз несколько раз.
Затем добавьте 40% глицерина и CDM в равных объемах для получения бактериальной суспензии с конечной концентрацией 20% глицерина. Залейте один миллилитр в микроцентрифужную пробирку, мгновенно заморозьте на сухом льду и сэкономьте при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Биопленку, выращенную аликвоты, разморозить на льду и отжимать при температуре 1 700 г в течение пяти минут.
Осторожно удалите и выбросьте надосадочную жидкость, не нарушая гранулы. Затем вымойте гранулу, ресуспендировав ее в одном миллилитре PBS, и снова открутите. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в объеме, необходимом для достижения желаемой концентрации.
Интраназально инокулируйте мышь-самца C57 от 10 до шестой колониеобразующих единиц или КОЕ путем пипетки пяти микролитров разбавленного инокулята в каждый нарис. После прививки крепко держите мышь, стабилизируя голову до тех пор, пока объем не вдохнет. Как только вирус оттает, разбавьте вирус в PBS до желаемой концентрации.
Нанесите офтальмологическую смазку на глаза мыши перед анестезией. Немедленно заразите анестезированную мышь 50 микролитрами 20 бляшеобразующих единиц или БОЕ вируса гриппа А или IAV интратрахеально, используя тупой пинцет, чтобы вытащить язык изо рта и пипетировать объем жидкости вниз по трахее. После выздоровления интраназально инокулируют 10 микролитров 200 БОЕ IAV с использованием метода инокуляции, описанного ранее.
Для сбора легких с помощью ножниц для рассечения разрежьте боковые стороны обнаженной грудной клетки и осторожно потяните ребра вверх к голове мыши, чтобы обнажить сердце. Вставьте иглу 25 калибра, прикрепленную к 10-миллилитровому шприцу, предварительно заполненному PBS, в правый желудочек и начните медленно перфузировать. Ищите отбеливание легких как показатель успешной перфузии.
Медленно промывайте, чтобы не повредить легочную ткань. Приподнимите сердце щипцами и сделайте разрез, чтобы отделить легкие и сердце. После отделения соберите все доли легкого щипцами и промойте в посуде со стерильным PBS, чтобы удалить остатки крови.
В чашке Петри нарежьте легкое небольшими кусочками и хорошо перемешайте. Удалите половину легочной смеси, чтобы определить бактериальный КОЕ или вирусный БОЕ, и поместите его в 15-миллилитровую пробирку с круглым дном, предварительно заполненную 0,5 миллилитрами PBS для гомогенизации. Удалите другую половину легкого для проточной цитометрии и поместите ее в 24-луночную пластину, обработанную нетканевой культурой, с предварительным заполнением каждой лунки 0,5 миллилитра RP10.
Оставить при комнатной температуре до обработки. Чтобы гомогенизировать собранную ткань, очистите зонд гомогенизатора, поместив его в 70% этанол и включив гомогенизатор на 60% мощности на 30 секунд. Повторите этот шаг в стерильной воде в течение 10 секунд.
Гомогенизируйте каждую ткань в течение одной минуты. Для перебора бактериальных номеров пластинчатые серийные разведения на пластинах с кровяным агаром. Чтобы рассчитать общее количество КОЕ, используйте 10 микролитров для пластины и запишите окончательный объем в миллилитрах для каждого образца.
Нанесите образцы носоглотки на пластины с кровяным агаром, дополненные тремя микрограммами на миллилитр гентамицина, чтобы выбрать рост S. pneumoniae при одновременном ингибировании роста других микроорганизмов. Инкубировать в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Для проточной цитометрии добавьте 500 микролитров буфера для разложения в каждую лунку 24-луночной пластины, содержащей образец легкого.
Выдерживают тарелку от 45 минут до одного часа. Далее с помощью микропипетки-1000 перемещают переваренные легкие и помещают их на фильтр. Затем используйте поршень трехмиллилитрового шприца, чтобы размять образец.
Рост биопленки Инокулят S.pneumoniae приводит к постоянному пневмококковому носительству, ограниченному носоглоткой, избегая при этом систематического распространения. Проявление заболевания у коинфицированных мышей S. pneumoniae IAV зависело от бактериального штамма. Хотя не было существенной разницы в количестве бактерий в носоглотке ни у одного из штаммов, S. pneumoniae, TIGR4 и D39, но не EF3030, распространились в легкие через 48 часов после заражения IAV.
У 40% мышей, инфицированных S. pneumoniae TIGR4, наблюдалась бактериальная диссеминация в легкие, и половина из них стала бактериемической. Мыши, инфицированные S. pneumoniae D39, показали 100% диссеминацию в легкие, и половина из них испытала бактериемию. При отслеживании общей выживаемости, независимо от бактериального штамма, выживаемость коинфицированных мышей была значительно ниже, чем у мышей, в одиночку зараженных S. pneumoniae.
Эта модель также использовалась для оценки наличия различных иммунных клеток в легких после инфекции IAV. Бактериальные штаммы D39 и TIGR4 вызвали значительное увеличение по сравнению с исходным уровнем притока воспалительных иммунных клеток из кровообращения, таких как нейтрофилы и моноциты, в то время как EF3030 этого не сделало. Одна только инфекция IAV вызвала значительное увеличение по сравнению с исходным уровнем притока иммунных клеток, таких как NK-клетки и гамма-дельта-Т-клетки.
Эти противовирусные реакции были значительно притуплены у мышей, интраназально инфицированных S. pneumoniae до вирусного заражения. У одноинфицированных мышей титры вируса не варьировались между молодыми и возрастными когортами. Старые мыши проявляли более ранние и значительно более серьезные признаки заболевания и умирали быстрее, в течение 24 часов, тогда как молодые контрольные группы лучше пережили инфекцию.
Разделение носительства и заболевания на отдельные этапы позволяет нам изучить как иммунный ответ, так и бактериальные и/или вирусные факторы, важные на разных этапах прогрессирования заболевания. Мы надеемся, что эта модель будет адаптирована другими лабораториями для изучения других полимикробных взаимодействий и взаимодействий патогенов хозяина на разных этапах прогрессирования заболевания и у различных хозяев.
